胡冬梅，王 芳，陳 忱

北大荒完達山乳業(yè)股份有限公司質(zhì)檢中心，黑龍江哈爾濱 150078

0 引言

維生素K1是一種脂溶性維生素，在空氣和潮濕環(huán)境下較穩(wěn)定，但在陽光下易被分解。維生素K1在天然綠色植物中廣泛存在，有多種生理功能和作用，主要包括抗出血、防止骨質(zhì)疏松、防治偏頭痛、防治胃腸道疾病等[1～3]。

維生素K1對嬰幼兒成長非常重要。嬰幼兒缺乏維生素K1，可能會導致先天性失明。維生素K1缺乏癥是一種獲得性、復合性、出血性疾病，由維生素K1缺乏引起，以有出血傾向、凝血因子缺乏或減少為特征。母乳中維生素K1的含量略低，新生兒生長發(fā)育快，對維生素K1需要量較大，容易攝入不足，需要額外通過藥物補充。故嬰幼兒配方乳粉（以下簡稱“嬰配粉”）中需要添加維生素K1來補充嬰幼兒成長所需的營養(yǎng)元素[4～7]。

目前對嬰配粉中脂溶性維生素含量研究主要集中檢測方法上，本文通過對比3 種不同的嬰配粉的貯存條件對含量的影響，進一步彌補維生素K1研究方法的空缺。本文采用《GB 5009.158—2016 食品安全國家標準 食品中維生素K1的測定》第一法高效液相色譜-熒光檢測法進行比較三種嬰配粉中脂溶性維生素K1在貯存過程中的穩(wěn)定性，在不同溫度貯存條件下維生素K1含量變化。試樣經(jīng)脂肪酶和淀粉酶酶解，正己烷提取樣品中的維生素K1后，用C18液相色譜柱將維生素K1與其他雜質(zhì)分離，鋅柱柱后還原，熒光檢測器檢測，外標法定量。通過數(shù)據(jù)對比，優(yōu)化貯存條件對脂溶性維生素K1含量的影響[8～12]。

1 材料與方法

1.1 儀器與標準品

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀（熒光檢測器） Perkin Elmer ；水浴磁力恒溫攪拌器 常州華奧儀器制造有限公司；萃取凈化振蕩器 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀IKA；氮吹儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；渦旋混合器IKA 。

1.1.2 維生素K1標準品

購買經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的維生素K1標準品（CAS號：84-80-0，純度≥99%）；維生素K1儲備液：濃度C=1.0 mg/mL；維生素K1工作液：濃度分別為0.100 0 μg/mL，0.200 0 μg/mL，0.300 0 μg/mL，0.400 0 μg/mL，0.500 0 μg/mL，0.600 0 μg/mL。

1.2 試劑

40%氫氧化鉀溶液；磷酸鹽緩沖液（pH值=8.0）；流動相：量取甲醇900.0 mL，四氫呋喃100.0 mL，冰乙酸0.3 mL，混勻后，加入氯化鋅1.50 g，無水乙酸鈉0.50 g，超聲溶解后，用0.22 μm有機系濾膜過濾。

1.3 試驗方法

隨機選取超市3 種不同品牌的嬰配粉（0～6個月），每個品牌選4 個樣品，共計12 個樣品，在陰涼干燥處（5 ℃）、常溫（20 ℃）、低溫（-18 ℃）及高溫（30 ℃）4 種貯存條件下，分別貯存4 周，每周測定1 次維生素K1含量變化。

1.4 樣品前處理與測定

1.4.1 樣品處理

（1）酶解

準確稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣2.50 g（精確到0.01 g，維生素K1含量不低于0.05 μg）于50.0 mL離心管中；加入5.0 mL溫水溶解，加入磷酸鹽緩沖液（pH值=8.0）5.0 mL，混勻；加入0.20 g脂肪酶和0.20 g淀粉酶（不含淀粉的樣品可以不加淀粉酶）；加蓋，渦旋2～3 min，混勻后，置于搖床振蕩器中振蕩2 h以上，使其充分酶解。

（2）提取

取出酶解好的試樣，分別加入10.0 mL乙醇及1.00 g碳酸鉀，混勻后加入10.0 mL正己烷和10.0 mL水，渦旋振蕩，將酶解液轉(zhuǎn)移至150.0 mL的分液漏斗中萃取提取，靜置分層（如發(fā)生乳化現(xiàn)象，可適當增加正己烷或水的加入量，以排除乳化現(xiàn)象），轉(zhuǎn)移上清液至100.0 mL旋蒸瓶中，向下層液再加入10.0 mL正己烷，重復操作1 次，合并上清液至上述旋蒸瓶中。

（3）濃縮

將上述正己烷提取液旋蒸至干（如有殘液，可用氮氣輕吹至干），用甲醇轉(zhuǎn)移并定容至5.0 mL容量瓶中，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，濾液待進樣。

1.4.2 色譜條件

（1）色譜柱

C18柱，柱長250.0 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5.00 μm，或具同等性能的色譜柱。

（2）鋅還原柱

柱長50.0 mm，內(nèi)徑4.6 mm。

（3）流動相

量取甲醇900.0 mL，四氫呋喃100.0 mL，冰乙酸0.3 mL，混勻后，加入氯化鋅1.5 g，無水乙酸鈉0.5 g，超聲溶解后，用0.22 μm有機系濾膜過濾。

（4）流速

流速為1 mL/min。

（5）檢測波長

激發(fā)波長為243 nm，發(fā)射波長為430 nm。

（6）進樣量

進樣量為10 μL。

2 結果分析

2.1 標準曲線、檢出限及樣品定量重復性

根據(jù)《GB 5009.158—2016 食品安全國家標準食品中維生素K1的測定》第一法 高效液相色譜-熒光檢測法的要求，測量范圍應覆蓋方法的最低濃度水平（定量限）和關注濃度水平，確定標準曲線濃度范圍為0.121 2 μg/mL、0.242 4 μg/mL、0.484 8 μg/mL、0.727 2 μg/mL、0.969 6 μg/mL、1.212 0 μg/mL（濃度均經(jīng)過分光光度計校正）測定標準曲線（規(guī)定曲線包含0點但是不強制過0點），每一點濃度測定3 次，使用3 次數(shù)據(jù)擬合得到以下線性參數(shù)，各濃度點對應的濃度和峰面積見表1。

表1 維生素K1標準溶液濃度與對應峰面積

從試驗結果可見，最終得出維生素K1的擬合標準曲線的線性方程Y=4.0×106X+2.42×104（圖1），此時R2=0.999 8。標準曲線線性回歸方程相關系數(shù)大于0.990 0，濃度范圍覆蓋關注濃度的0%～150%，滿足《GB/T 27417—2017 合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》的要求。

圖1 維生素K1標準溶曲線

采用標準偏差法，選擇陰性樣品（即試樣中本身不含有維生素K1）試樣，稱取10 份，每份稱取1.0 g左右，按標準方法進行檢測按LOD的表示方法為3 s，LOQ為3 倍的LOD（（表2）。

表2 維生素K1方法檢出限與定量限結果

從試驗結果可見，奶粉稱樣量為1.0 g，定容體積為5.0 mL時，方法檢出限為0.74 μg/100 g，方法定量限為2.23 μg/100 g。低于該方法規(guī)定的檢出限和定量限（稱樣量為1.00 g，定容體積為5.0 mL時，方法檢出限為1.5 μg/100 g，方法定量限為5.00 μg/100 g）。

2.2 不同品牌貯藏期維生素K1含量變化

選取3 種品牌的嬰兒配方奶粉12 個樣品，在陰涼干燥處（5 ℃）、常溫（20 ℃）、低溫（-18 ℃）及高溫（30 ℃）4 種貯藏條件下，分別貯存4 周，每周測定1 次維生素K1含量變化，結果如圖3所示。

如圖3所示，不同品牌在不同貯存溫度下維生素K1含量有所不同，3 種品牌最初測定維生素K1含量分別為30.40 μg/100 g、29.70 μg/100 g、30.80 μg/100 g，由圖所示，貯存條件在陰涼干燥處（5 ℃）、常溫（20 ℃）隨時間變化含量下降幅度較小，可忽略不計；低溫（-18 ℃）及高溫（30 ℃）隨時間變化含量有所下降，表明低溫和高溫均會對維生素K1含量有所影響。

圖2 維生素K1含量擬合結果圖

圖3 不同品牌貯存期維生素K1含量變化

3 討論

維生素K1是促進血液正常凝固及骨骼生長的重要維生素，成人需求量少，但新生兒卻極易缺乏維生素K1。維生素K1在嬰配粉中的含量能夠補充新生兒所需，為新生兒的生長發(fā)育提供了重要保障。本文主要研究結果顯示，嬰配粉中的維生素K1的含量在陰涼干燥環(huán)境下和常溫環(huán)境下，維生素K1含量幾乎沒有變化。但低溫和高溫均會影響維生素K1的含量，主要原因可能由于低溫或高溫條件下引起維生素K1分解，導致其含量減少。維生素K在未來幾年仍將是令人矚目的研究領域[13～15]。