王琪瑋 張敬東

[摘要] 目的 明確結直腸癌（CRC）病人西妥昔單抗治療前后EPHA2的表達水平，并探索EPHA2抗體能否逆轉西妥昔單抗的耐藥。

方法 收集8例KRAS野生型CRC病人在西妥昔單抗治療前及疾病進展后的配對腫瘤組織標本，采用免疫組化方法檢測EPHA2的表達水平。使用西妥昔單抗處理其敏感細胞系、原發(fā)及繼發(fā)耐藥的CRC細胞系，以MTT方法檢測細胞增殖能力。使用EPHA2抗體DS-8895a、西妥昔單抗單藥或聯(lián)合處理原發(fā)及繼發(fā)耐藥的CRC細胞，檢測各組細胞增殖能力。

結果 在西妥昔單抗治療前及進展后的腫瘤組織中，存在治療后EPHA2表達的上調（t=6.056，P<0.05）。在KRAS野生型CRC細胞系中，DS-8895a與西妥昔單抗有協(xié)同增敏作用;而在西妥昔單抗繼發(fā)耐藥CRC細胞系中，DS-8895a可逆轉西妥昔單抗的耐藥。

結論 EPHA2抗體與西妥昔單抗聯(lián)合可能具有逆轉西妥昔單抗繼發(fā)耐藥作用，以及潛在的協(xié)同增敏作用。EPHA2有可能成為CRC治療策略的新突破。

[關鍵詞] 結直腸腫瘤;受體，EphA2;西妥昔單抗;抗藥性，腫瘤

[中圖分類號] R735.34，R345.57

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）03-0416-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.125

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210628.1638.006.html;2021-06-29 14：07：31

REVERSAL EFFECT OF EPHA2 ANTIBODY ON CETUXIMAB RESISTANCE IN COLORECTAL CANCER

WANG Qiwei， ZHANG Jingdong

（Medical Oncology Department of Gastrointestinal Cancer， Cancer Hospital of China Medical University， Shenyang 110042， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression level of EPHA2 before and after cetuximab treatment in patients with colorectal cancer （CRC）， and to explore whether the EPHA2 antibody can reverse the resistance to cetuximab in CRC cell lines.

Methods Paraffin specimens of tumor tissues from eight KRAS wild-type CRC patients before and after treatment with cetuximab were collected， and the expression of EPHA2 was determined? by immunohistochemistry. Cetuximab-sensitive， primary-resistant， and acquired-resistant CRC cell lines were treated with cetuximab， and the cell proliferation was measured by MTT method. The primary-resistant and acquired-resistant CRC cells were treated with EPHA2 antibody DS-8895a and cetuximab， alone or in combination， and the cell proliferation was assessed.

Results In the tumor tissues before and after cetuximab treatment， the expression of EPHA2 was up-regulated after treatment （t=6.056，P<0.05）. In KRAS wild-type CRC cell line， DS-8895a and cetuximab had synergistic sensitization， while in CRC cell line with acquired resistance to cetuximab， DS-8895a reversed the resis-

tance to cetuximab.

Conclusion The combination of EPHA2 antibody and cetuximab may reverse the acquired resistance to cetuximab and have potential synergistic sensitization effects. EPHA2 may become a new target for the treatment of CRC.

[KEY WORDS]colorectal neoplasms; receptor， EphA2;? cetuximab;? drug resistance， neoplasm

結直腸癌的發(fā)病率居我國惡性腫瘤的第2位，死亡率居第5位[1]。以西妥昔單抗為代表的抗細胞生長因子受體（EGFR）單抗，被廣泛用于KRAS基因野生型轉移性結直腸癌（mCRC）病人的轉化[2-5]及姑息治療中[6-7]。然而，西妥昔單抗與化療聯(lián)合的客觀有效率僅為55%～65%，中位無進展生存期為10～11月，這意味著有近半數(shù)的病人未能獲益，并且有效的病人多在1年內出現(xiàn)進展[6，8]。因此，探討西妥昔單抗的原發(fā)及繼發(fā)耐藥機制并嘗試進行逆轉具有重要的基礎及臨床意義。除了研究較充分的耐藥機制，如KRAS、NRAS、BRAF、PI3K等基因突變導致下游通路的持續(xù)激活[9]，近年來的研究顯示，結直腸癌中EPHA2的過表達與腫瘤轉移和更差的預后相關，且可能與西妥昔單抗的療效相關[10-14]。EPHA2是促紅細胞生成素產生肝細胞受體（EPH）家族的成員之一，目前關于EPHA2靶向治療能否逆轉西妥昔單抗的耐藥尚無深入研究。本研究旨在明確CRC病人西妥昔單抗治療前后EPHA2的表達水平，并在原發(fā)及繼發(fā)CRC耐藥細胞系中探索EPHA2抗體能否逆轉西妥昔單抗的耐藥。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 抗體與試劑 BCA蛋白濃度檢測試劑盒（由美國Thermo Fisher Scientific公司提供）;β-actin抗體、EPHA2抗體、pEPHA2抗體（美國Sigma公司）;RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Hyclon公司）;胎牛血清（BI公司）;胰蛋白酶（杭州四季青生物工程材料有限公司）;MTT試劑（美國Sigma公司）;山羊抗兔二抗（美國Abcam公司），DS-8895a（日本Daiichi Sankyo公司）。

1.1.2 細胞系 人結直腸癌細胞系HCT116購自中國科學院上海細胞庫，人結直腸癌細胞系HKH-2由日本國際醫(yī)學中心研究所的SHIRASAWA博士轉贈。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 使用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基分別對HKH-2和HCT116細胞進行培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗時取對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 細胞活性檢測 細胞用不同藥物處理72 h后，用MTT方法檢測細胞活性。酶標儀檢測細胞在450 nm波長處的吸光度值，根據(jù)吸光度值計算不同藥物濃度對應的細胞活性，繪制細胞增殖曲線。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達 細胞用不同藥物處理24 h后，收取細胞，加入胰蛋白酶和磷酸酶抑制劑，加入CytoBuster蛋白提取試劑提取總蛋白后，用BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品于含體積分數(shù)0.10的SDS-PAGE中電泳后轉移到硝酸纖維素膜上，加入一抗4 ℃搖床上過夜，加入二抗室溫孵育1 h，ECL法顯色。在凝膠成像系統(tǒng)中成像拍照，以β-actin標定。

1.2.4 免疫組化檢測 選取2017年7月—2017年12月在遼寧省腫瘤醫(yī)院行轉化治療（西妥昔單抗聯(lián)合化療）后出現(xiàn)疾病進展的8例結直腸癌病人，年齡43～65歲，8例病人在轉化治療前經腸鏡活檢病理確診為結直腸腺癌，在疾病進展后均接受姑息性手術治療，術后病理均診斷為結直腸腺癌。本研究選取該8例病人在轉化治療前的腸鏡活檢標本蠟塊，以及轉化治療后的結直腸癌原發(fā)灶手術標本蠟塊，標本的組織蠟塊均保存于我院病理科。使用切片機對石蠟包埋的腫瘤組織進行切片，厚度4～5 μm，置于60 ℃恒溫干燥箱中烘烤4 h。切片脫蠟水化，之后于體積分數(shù)0.03 H2O2中室溫搖床孵育10 min，PBS清洗3次。將其放入含有EDTA抗原修復液的鍋中，煮沸、冷卻并清洗。使用50 g/L的BSA抗原封閉1 h，滴加一抗后于濕盒中4 ℃孵育過夜。復溫后二抗孵育1 h，以DAB顯色、蘇木精復染，鹽酸乙醇分化、梯度脫水及封片，風干后保存。免疫組化結果判定由病理科醫(yī)生按照如下標準獨立進行。染色強度被分為4級：未著色評分為0，著色較弱評分為1分，染色中等和高強度分別評分為2分和3分。染色強度乘以染色細胞的百分比（1%～100%）獲得H-score，H-score范圍為0～300。見圖1A。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)間比較使用配對t檢驗，多組均數(shù)間比較使用雙因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結? 果

2.1 結直腸癌組織中西妥昔單抗耐藥后EPHA2表達上調

本研究收集了8例KRAS野生型結直腸癌病人在西妥昔單抗治療前及疾病進展后的配對的腫瘤組織石蠟標本，使用免疫組化方法檢測了EPHA2的表達水平，以免疫組化評分表示EPHA2表達水平。見圖1A。結果顯示，在西妥昔單抗耐藥后的結直腸癌組織中，存在EPHA2表達的明顯上調（t=6.056，P<0.05），EPHA2上調可能與西妥昔單抗的繼發(fā)耐藥相關。見圖1B、C。

2.2 西妥昔單抗對3種不同CRC細胞的增殖活力和EPHA2及pEPHA2表達影響

本研究前期選用KRAS野生型（KRAS-WT）的西妥昔單抗敏感CRC細胞系HKH-2，給予遞增濃度的西妥昔單抗處理并多次傳代5個月后，已成功構建對西妥昔單抗耐藥的CRC細胞系HKH-2/CR，以及KRAS突變型（KRAS-MT）的CRC細胞系HCT116。分別使用遞增濃度的西妥昔單抗處理HKH-2細胞、HKH-2/CR細胞和HCT116細胞，采用MTT方法檢測細胞增殖活力，使用GraphPad Prism繪制細胞增殖曲線。結果表明，藥物濃度和不同細胞系有交互作用（F藥物=407.50，P<0.05;F細胞系=4 981.00，P<0.05;F藥物×細胞系=67.57，P<0.05）。加入西妥昔單抗處理細胞后，HKH-2/CR細胞和HCT116細胞存在明顯耐藥性;而HKH-2細胞則對西妥昔單抗的處理相對敏感，加入西妥昔單抗后，細胞生長受到抑制。見圖2A。在HKH-2細胞中，使用Western blot法分別檢測細胞在西妥昔單抗（10 nmol/L）處理前及其處理后1、12、24 h的EPHA2和pEPHA2表達水平，結果顯示，西妥昔單抗給藥后EPHA2及pEPHA2表達水平均明顯上調。見圖2B。

2.3 EPHA2抗體或（和）西妥昔單抗對HKH-2細胞增殖活力影響

在KRAS-WT的西妥昔單抗敏感CRC細胞系HKH-2中，分別用不同濃度的EPHA2抗體DS-8895a、西妥昔單抗、DS-8895a聯(lián)合西妥昔單抗處理細胞，其中聯(lián)合用藥組中DS-8895a的濃度固定為10 nmol/L，采用MTT法檢測各組細胞增殖能力。結果顯示，藥物濃度以及不同細胞系有交互作用（F藥物=1 936.00，P<0.05;F細胞系=4 137.00，P<0.05;F藥物×細胞系=228.70，P<0.05）。DS-8895a與西妥昔單抗具有明顯的協(xié)同作用。見圖3。

2.4 EPHA2抗體或（和）西妥昔單抗對HKH-2/CR細胞繼發(fā)耐藥影響

在西妥昔單抗繼發(fā)耐藥的CRC細胞系HKH-2/CR中，分別使用不同濃度的EPHA2抗體DS-8895a、西妥昔單抗、DS-8895a聯(lián)合西妥昔單抗處理細胞，其中聯(lián)合用藥組中DS-8895a的濃度固定為10 nmol/L，采用MTT法檢測各組細胞的增殖能力。結果顯示，藥物濃度和不同細胞系存在交互作用（F藥物=600.70，P<0.05;F細胞系=8 031.00，P<0.05;F藥物×細胞系=91.13，P<0.05）。在對西妥昔單抗繼發(fā)耐藥的CRC細胞HKH-2/CR中，EPHA2抗體DS-8895可能有逆轉西妥昔單抗繼發(fā)耐藥的作用。見圖4。

3 討? 論

EPH家族是人類基因組中最大的酪氨酸激酶受體家族，而EPHA2是EPH家族中的一個重要成員，其在多種上皮來源的組織和細胞系中廣泛表達[11]。EPHA2在正常細胞的惡性轉化、血管生成、腫瘤轉移和治療耐藥中的作用已在多種腫瘤中得到廣泛研究，特別是在乳癌[15]、胰腺癌[16，17]、非小細胞肺癌[18]、黑色素瘤[19]和頭頸部鱗癌[20]等腫瘤中。在非小細胞肺癌中，EPHA2的過表達與EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）的治療耐藥相關，抗EPHA2治療可逆轉EGFR-TKI耐藥[11]。在頭頸部鱗癌中EPHA2的過表達與西妥昔單抗的療效相關[19]。既往我們對于EPHA2在結直腸癌組織中的表達及意義并不十分了解，但近年來研究結果顯示，EPHA2可能是促進結直腸癌侵襲轉移的驅動基因，結直腸癌中EPHA2表達與西妥昔單抗的療效呈負相關[10-11]，為西妥昔單抗提供了潛在的療效預測標志物。然而，關于EPHA2靶向治療能否逆轉西妥昔單抗的耐藥尚無深入研究。

本研究在西妥昔單抗治療前及疾病進展后配對的腫瘤組織中，觀察到繼發(fā)耐藥后存在EPHA2的表達上調。而既往研究多為檢測治療前EPHA2表達水平對西妥昔單抗療效影響[13，21]，即原發(fā)耐藥與EPHA2的關系，罕見報道EPHA2水平與西妥昔單抗繼發(fā)耐藥的關系。此外，本研究首次報道了新型EPHA2抗體DS-8895a與西妥昔單抗有協(xié)同增敏作用，而且在繼發(fā)耐藥細胞系中可逆轉西妥昔單抗的耐藥，結果與MARTINI等[21]報道的EPHA2抗體ALW-II-41-27可逆轉西妥昔單抗的結論一致。因此，我們認為EPHA2靶點可能成為結直腸癌中逆轉西妥昔單抗耐藥的一個新方向。目前，EPHA2已逐漸成為多種腫瘤治療的潛在靶點[22]，EPHA2抗體DS-8895a在實體瘤的Ⅰ期臨床研究中表現(xiàn)出了良好的安全性[23]，我們期待未來在結直腸癌病人中驗證DS-8895a對西妥昔單抗的逆轉耐藥及增敏作用。然而，本研究尚未對EPHA2抗體逆轉西妥昔單抗耐藥的機制做進一步的探討。有研究表明，EPHA2受體及配體Ephrin-A1，可形成一個重要的細胞通訊系統(tǒng)[24]，EPHA2可通過調節(jié)配體依賴性和非配體依賴性信號傳導來抑制和促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[20]。在無配體情況下，非配體依賴性的EPHA2通路在RAS/ERK/RSK下游信號通路中起關鍵作用[10]。EPHA2抗體逆轉結直腸癌西妥昔單抗耐藥的作用機制仍有待深入探討。

綜上所述，EPHA2抗體與西妥昔單抗聯(lián)合應用可能有逆轉西妥昔單抗繼發(fā)耐藥的作用，以及潛在的協(xié)同增敏作用。本研究為結直腸癌治療中逆轉西妥昔單抗耐藥提供了新的理論依據(jù)，EPHA2有可能成為結直腸癌治療策略的新突破。

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（本文編輯 于國藝）