田宗林， 喻奇?zhèn)ィ?姜超英， 鄭登峰， 熊 晶， 滕建輝，陳 倩， 羅 雯， 莫澤君， 段麗麗， 劉仁祥

(1.貴州大學煙草學院，貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室， 貴陽 550025；2.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司， 貴州 畢節(jié) 551700；3.貴州省煙草公司， 貴陽 550001)

雜種優(yōu)勢是生物界的一種普通現(xiàn)象，雜種優(yōu)勢利用也是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的一種重要育種方法，在水稻、玉米、小麥、棉花、油料等作物生產(chǎn)上已經(jīng)得到了廣泛的應用，特別是水稻和玉米雜交種的大面積利用對我國乃至世界糧食增產(chǎn)和安全作出了巨大貢獻[1]。雜種優(yōu)勢是指兩個遺傳性不同的親本雜交產(chǎn)生的雜種后代在生長勢、生活力、繁殖力、適應性以及產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀方面超過其雙親的現(xiàn)象[2-3]。中親優(yōu)勢、超親優(yōu)勢和超標優(yōu)勢等雜種優(yōu)勢度量指標，從不同層面反映了雜種優(yōu)勢的強弱，因此，根據(jù)研究雜種優(yōu)勢的目標，科學設計相應的試驗并采用合理的度量指標是提高雜種優(yōu)勢研究效率的關鍵。在雜交種選育過程中，育種工作者往往將雜交組合安排在生態(tài)環(huán)境差異大的點，并采用當?shù)刈罴训纳a(chǎn)技術措施進行多點試驗，測定超標優(yōu)勢及超親優(yōu)勢以鑒定雜交組合的利用潛力。目前，未見有關不同生態(tài)環(huán)境、不同栽培措施對雜種優(yōu)勢是否有影響的研究報道，研究者往往根據(jù)雜交種選育的試驗方法就認為不同生態(tài)環(huán)境、不同栽培措施對雜種優(yōu)勢有影響，在測定中親優(yōu)勢的雜種優(yōu)勢遺傳及形成機制研究中，也將F1及其親本安排在不同試驗點，并采用不同的栽培措施進行試驗，導致人力物力的投入大、研究效率不高。

煙草是生物學機制研究的理想模式植物。煙堿是在煙草的根部合成、通過木質(zhì)部運輸?shù)饺~片的液泡中積累的一種長距離運輸次生代謝物，是衡量煙葉質(zhì)量的一個重要因素[4-5]，其合成代謝過程十分復雜。煙堿具有顯著的雜種優(yōu)勢[6-7]，利用雜種優(yōu)勢調(diào)控煙堿，對于煙草育種和煙堿生產(chǎn)均具有重要的實踐意義[8-9]。前期利用煙草根轉錄組分析揭示了超顯性在煙葉煙堿雜種優(yōu)勢形成中的關鍵作用，發(fā)現(xiàn)N-甲基轉移酶(PMT)、天冬氨酸氧化酶(AO)、喹啉合酶(QS)等參與煙堿合成和煙堿轉運相關基因在雜交種根部表達水平顯著上調(diào)，證實了雜交種具有更高的煙堿合成效率是煙堿雜種優(yōu)勢形成的主要原因之一[10]。為此，本研究以3個組合及其親本為研究對象，設置不同生態(tài)環(huán)境、打頂和不打頂處理，測定不同處理煙葉煙堿含量、煙葉煙堿含量雜種優(yōu)勢值，以及與煙堿雜種優(yōu)勢相關的PMT、AO、QS基因的相對表達量，探討生態(tài)環(huán)境和打頂措施對煙堿含量雜種優(yōu)勢的影響，以期為提高作物雜種優(yōu)勢研究利用效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 參試材料

在前期研究基礎上，選擇雜種優(yōu)勢差異較大的Va 116×巴斯馬、Va 116×GDH 88、K 326×青梗等3個組合，及其親本K 326、Va 116、GDH 88、青梗、巴斯馬為試驗材料。所有材料均由貴州煙草品質(zhì)研究重點實驗室提供。

1.2 田間試驗方法

1.2.1試驗點設置

為了盡可能擴大試驗點的差異，試驗于2019—2020年分別在貴州大學煙草科研基地、威寧縣煙草科技園、德江縣煙草科技園進行。貴州大學煙草科研基地位于西秀區(qū)楊武鄉(xiāng)，26.055 433 1°N，106.158 200 2°E，海拔1 250 m；威寧縣煙草科技園位于貴州省威寧縣黑石頭鎮(zhèn)，26.745 244 1°N，104.017 612 3°E，海拔2 200 m；德江縣煙草科技園位于德江縣煎茶鎮(zhèn)，28.267 264 9°N，108.116 321 1°E，海拔600 m。選擇基地內(nèi)最具代表性的地塊作為試驗地。

1.2.2田間試驗設計

各試驗點均采用隨機區(qū)組設計，2次重復，每個小區(qū)種植4行，每行種植15株，行株距為110 cm×55 cm。每個地區(qū)實驗地的重復實驗區(qū)周邊設置兩行保護行，每行第一株和最后一株不參與取樣。除試驗設置的打頂及不打頂處理外，其施肥、密度等所有生產(chǎn)技術和管理措施均按照當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術方案執(zhí)行。

1.2.3打頂處理的方法

在威寧試驗點設置打頂和不打頂處理，其余試驗點均打頂。打頂采取50%試驗材料的中心花開放50%時，同一天打頂，所有處理的留葉數(shù)均為18片。

1.3 測定項目及方法

1.3.1取樣方法

取樣在煙堿雜種優(yōu)勢表現(xiàn)最大的打頂當天和打頂后7天兩個時期進行[7,11]。取樣時，每一小區(qū)隨機選擇3株，取中部9～11葉位葉片，于105 ℃下殺青30 min，然后在75 ℃下烘干后用于煙堿含量測定。在取煙堿測定樣品的同時，取植株幼嫩的根器官等量混合，保存于-86 ℃超低溫冰箱中，用于相關基因表達量的測定。

1.3.2煙堿的測定方法

采用《煙葉化學》中的“紫外分光光度計法”進行煙堿含量測定[12]。

1.3.3相關基因表達量的測定

1)樣品總RNA提取與cDNA合成

參照OMIGA E.Z.N.A.TM Plant RNA Protocol II(for difficult samples)提取總RNA，cDNA合成的20 μL反應體系按試劑盒說明書(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit，ABI)進行。

2)引物設計

選擇PMT、AO、QS3個基因，在NCBI上查找目的基因的序列，根據(jù)熒光定量PCR引物設計原則，利用Primer Premier 5.0軟件和Beacon Disgner軟件，設計目的基因的引物，引物序列詳見表1。引物由北京擎科生物技術有限公司合成。

表1 Real-time PCR檢測基因的引物序列

3)實時熒光定量 PCR分析

用Talent qPCR PreMix(SYBR Green)試劑盒進行基因表達量測定。用比較閾值法公式進行計算，并用Excel軟件和Origin軟件處理分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計分析方法

實驗數(shù)據(jù)以小區(qū)為單位，進行煙堿含量、煙堿雜種優(yōu)勢值、煙堿雜種優(yōu)勢相關基因相對表達量的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用Excel 2013軟件和DPS 14.10統(tǒng)計軟件對相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.4.1雜種優(yōu)勢的計算方法

中親優(yōu)勢=[(F1-MP)/MP]×100%；

超親優(yōu)勢=[(F1-HP)/HP]×100%；

超標優(yōu)勢=[(F1-ck)/ck]×100%。

式中：MP為雙親平均值；HP為高親值；F1為雜種一代的數(shù)值；ck為K 326。

1.4.2煙堿雜種優(yōu)勢相關基因相對表達量的計算方法

采用王秀莉等[13]的比較閾值法對強、弱優(yōu)勢代表材料中相關基因的Real-time PCR測定結果進行相對定量分析，根據(jù)測定的Ct值，計算各雜交種及雙親中的基因相對表達量值。然后計算各基因的中親表達優(yōu)勢后，再與煙堿含量的雜種優(yōu)勢進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 生態(tài)環(huán)境和打頂對煙葉煙堿含量的影響

2.1.1生態(tài)環(huán)境對煙葉煙堿含量的影響

由不同品種在不同環(huán)境處理下的煙堿含量結果(表2)看出，3個試驗點間的煙葉煙堿含量差異顯著，德江試驗點的煙葉煙堿含量最高、威寧點次之，楊武點最低；說明環(huán)境對煙葉煙堿含量有明顯的影響。不同品種間煙葉煙堿含量也存在差異，青梗的煙葉煙堿含量最高，為1.233 6%；Va116的煙葉煙堿含量最低，為0.518 1%。表明本研究選用的生態(tài)試驗點和參試材料有較強的代表性。

表2 參試材料在不同環(huán)境下的煙堿含量

2.1.2打頂對煙葉煙堿含量的影響

打頂是煙葉生產(chǎn)中的一項重要的農(nóng)藝措施。由表3可看出，打頂處理7 d后，煙葉煙堿含量高于不打頂處理，打頂和不打頂處理間差異達顯著水平，說明打頂對煙葉煙堿含量有明顯調(diào)控作用，表明本研究選用打頂和不打頂處理代表農(nóng)藝措施進行比較有較強的代表性。

表3 參試材料打頂和不打頂?shù)臒焿A含量

2.2 生態(tài)環(huán)境和打頂對煙堿含量雜種優(yōu)勢的影響

2.2.1生態(tài)環(huán)境對煙堿含量雜種優(yōu)勢的影響

由表4可看出，同一雜交組合煙葉煙堿含量的中親優(yōu)勢在3個試驗點間的差異均不顯著，3個組合中親優(yōu)勢平均值在3個試驗點間的差異也不顯著；同一雜交組合煙葉煙堿含量的超親優(yōu)勢、超標優(yōu)勢值在3個試驗點間的差異達到顯著，3個組合超親優(yōu)勢、超標優(yōu)勢平均值在3個試驗點間的差異也達到顯著。結果表明，在雜種優(yōu)勢研究利用中，因雜種優(yōu)勢度量指標的不同，對雜交種優(yōu)勢的評價結果也不同；同一雜交組合中親優(yōu)勢值不因試驗地點的改變而產(chǎn)生明顯的變化，而超親優(yōu)勢值、超標優(yōu)勢值因試驗地點的改變而產(chǎn)生了明顯差異。

表4 不同生態(tài)環(huán)境下3個雜交組合的煙堿含量雜種優(yōu)勢

2.2.2打頂對煙堿含量雜種優(yōu)勢的影響

由表5可看出，同一雜交組合煙葉煙堿含量的中親優(yōu)勢在打頂和不打頂處理間的差異均不顯著，3個組合中親優(yōu)勢平均值在打頂和不打頂處理間的差異也不顯著；而超親優(yōu)勢、超標優(yōu)勢值在不同雜交組合間及打頂和不打頂處理間的差異達到顯著。結果表明，在雜種優(yōu)勢研究利用中，因雜種優(yōu)勢度量指標的不同，對雜交種優(yōu)勢評價的結果也不同；同一雜交組合中親優(yōu)勢值不因農(nóng)藝措施的改變而產(chǎn)生明顯的變化，而超親優(yōu)勢值、超標優(yōu)勢值因農(nóng)藝措施的不同產(chǎn)生了明顯差異。

表5 打頂與不打頂措施下3個雜交組合的煙堿含量雜種優(yōu)勢

2.3 生態(tài)環(huán)境和打頂對煙堿雜種優(yōu)勢相關基因表達量的影響

2.3.1生態(tài)環(huán)境對煙堿雜種優(yōu)勢相關基因表達量的影響

生物的性狀調(diào)控是由基因和環(huán)境共同控制蛋白酶合成來實現(xiàn)的，由表6可知，同一組合同一基因的表達量中親表達優(yōu)勢在不同試驗點間的差異不顯著，3個試驗點間3個組合煙葉煙堿含量雜種優(yōu)勢相關基因表達量中親表達優(yōu)勢的平均值的差異也不顯著。說明生態(tài)環(huán)境對煙葉煙堿含量雜種優(yōu)勢相關基因表達量的中親表達優(yōu)勢沒有明顯的影響，研究結果從基因表達水平上證明了不同生態(tài)環(huán)境對煙葉煙堿含量中親優(yōu)勢沒有顯著影響這一研究結果的可靠性。

表6 不同生態(tài)環(huán)境下的煙堿雜種優(yōu)勢相關基因的中親表達優(yōu)勢

2.3.2打頂對煙堿雜種優(yōu)勢相關基因表達量的影響

由表7可看出，打頂處理7 d后，打頂和不打頂處理間同一組合同一基因的表達量的中親表達優(yōu)勢差異不顯著，打頂和不打頂處理間3個組合煙葉煙堿含量雜種優(yōu)勢相關基因表達量中親表達優(yōu)勢平均值的差異也不顯著。說明打頂處理對煙葉煙堿含量雜種優(yōu)勢相關基因表達量中親表達優(yōu)勢沒有明顯的影響，研究結果從基因表達水平上證明了打頂措施對煙葉煙堿含量中親優(yōu)勢沒有顯著影響這一研究結果的可靠性。

表7 打頂與不打頂措施下的相關基因的中親表達優(yōu)勢

3 討 論

煙堿是在煙草的根部合成[14]、通過木質(zhì)部運輸?shù)饺~片的液泡中積累[15]的長距離運輸次生代謝物，占煙草生物堿總含量的90%～95%[16]，是煙草商業(yè)性使用的物質(zhì)基礎[17]。此外，煙堿在醫(yī)藥、化工、病蟲生物防治領域也有廣泛應用。研究表明，煙葉中煙堿含量受土壤氮、磷、鉀營養(yǎng)元素以及土壤pH值、質(zhì)地、溫、光、水、海撥高度等生態(tài)環(huán)境的影響較大[18-21]，施氮量對煙草生長和煙堿的積累影響最大[22]，對煙堿積累的調(diào)節(jié)作用超過其他營養(yǎng)元素，且與煙堿的含量呈正相關關系[23]；煙葉煙堿含量與成熟期積溫和日照時數(shù)呈正相關，與降雨量呈負相關，其中日照時數(shù)對煙堿含量的影響最大[24]。打頂是煙草栽培中的重要農(nóng)藝措施，對煙葉煙堿含量的影響很大[25-26]，煙株合成煙堿的能力在打頂前后發(fā)生了極大的變化，打頂可加速煙草株體內(nèi)煙堿的合成[27]，提高煙葉煙堿含量；早打頂且抹去腋芽的煙株煙葉煙堿含量高，煙葉品質(zhì)差[28]。本研究結果表明，生態(tài)環(huán)境和打頂措施對煙葉煙堿含量有明顯的影響，煙葉生產(chǎn)中煙堿含量的調(diào)控措施要因煙區(qū)環(huán)境而異，打頂也是調(diào)控煙葉煙堿含量的重要措施。

雜種優(yōu)勢是生物界的一種普通現(xiàn)象，雜種優(yōu)勢利用也是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的一種重要育種方法，在水稻、玉米、小麥、棉花、油料等作物生產(chǎn)上已經(jīng)得到了廣泛的應用[3]。雜種優(yōu)勢的強弱可以通過測算配合力來估計，而較為普遍的方法是直接采用中親優(yōu)勢、超親優(yōu)勢和超標優(yōu)勢從不同層面度量雜種優(yōu)勢強弱。中親優(yōu)勢表示雜種F1中能固定遺傳的部分，用于雜種優(yōu)勢遺傳理論研究；超親優(yōu)勢是雜種F1在生產(chǎn)上利用的前提，直接反映了雜交組合的利用潛力；超標優(yōu)勢是衡量雜種F1生產(chǎn)利用價值最直接的指標。本研究結果表明，不同生態(tài)環(huán)境、打頂與不打頂處理間煙葉煙堿含量的中親優(yōu)勢值差異不顯著，而超親優(yōu)勢值、超標優(yōu)勢值差異顯著，表明在雜種優(yōu)勢研究中，根據(jù)研究目標選擇合理的雜種優(yōu)勢度量指標，對于提高雜種優(yōu)勢研究利用效率尤為重要。在雜交種利用價值評價為目標的研究中，應將雜交組合安排在生態(tài)環(huán)境差異大，并采用當?shù)刈罴训纳a(chǎn)技術措施進行多點試驗，測定超親優(yōu)勢或超標優(yōu)勢即可度量雜種F1的生產(chǎn)利用價值，各種作物多年多點品種區(qū)域試驗的理論依據(jù)亦在于此。在以解析雜種優(yōu)勢遺傳調(diào)控機理為目標的研究中，只需將雜種F1及其雙親在相同條件下種植，測定中親優(yōu)勢即可評價雜種優(yōu)勢的強弱，可大幅度減少人力物力的投入，提高研究效率。

生物的性狀調(diào)控是由基因和環(huán)境共同控制蛋白酶的合成來實現(xiàn)，其表達量與數(shù)量性狀表現(xiàn)值有關。本研究在前期研究的基礎上，測定不同生態(tài)環(huán)境、打頂和不打頂處理下煙葉煙堿含量雜種優(yōu)勢相關基因PMT、AO、QS的相對表達量，基因表達量的中親表達優(yōu)勢統(tǒng)計結果顯示，不同試驗點、打頂與不打頂處理間煙葉煙堿含量雜種優(yōu)勢相關基因表達量的中親表達優(yōu)勢值差異不顯著，結果從基因表達水平上證實了生態(tài)環(huán)境、打頂處理對煙葉煙堿含量的中親優(yōu)勢無顯著影響這一研究結果的可靠性。

4 結 論

生態(tài)環(huán)境和打頂對煙葉煙堿含量的中親優(yōu)勢值沒有顯著的影響，在以解析雜種優(yōu)勢遺傳調(diào)控機理為目標的研究中，可以不考慮生態(tài)環(huán)境和打頂?shù)挠绊?，在同一試驗點對雙親及F1采用相同的農(nóng)藝措施就能獲得較為準確的雜種優(yōu)勢鑒定結果，研究結果為降低雜種優(yōu)勢研究的投入、提高研究效率提供了理論依據(jù)。本研究雖然進行了2年3個點的試驗，但為了避免田間試驗規(guī)模過大對試驗結果的準確性造成負面影響，只選擇了雜種優(yōu)勢差別較大的3個雜種F1及其5個親本為材料；同時，本研究僅以煙葉煙堿含量性狀的雜種優(yōu)勢為研究對象，其他作物或其它性狀的雜種優(yōu)勢是否具有同樣的規(guī)律，還有待更多的研究者做進一步的驗證。