袁清敏 馮保靜 王國慶 劉會娟 王獻利

牙周炎作為一種高發(fā)病率的慢性炎癥疾病，是成年人牙齒脫落的主要原因［1，2］。近年來PDLSCs已被證明在小鼠移植時可形成異位牙骨質(zhì)/韌帶樣復(fù)合體［3］。因此，研究炎癥微環(huán)境下PDLSCs成骨分化的分子機制具有重要意義。研究表明，腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNFα的過度釋放會導(dǎo)致牙周和骨組織的損傷，如牙槽骨缺損、牙槽窩缺損、牙支持組織缺損等［4］。此外，研究證實TNFα可抑制牙周膜干細胞的成骨向分化［5］。因此，深入研究炎癥微環(huán)境下hPDLSCs成骨向分化的調(diào)控機制在牙周膜干細胞的臨床應(yīng)用具有重要作用。

MicroRNAs(miRNAs）已被證明參與調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂和成骨分化［6］。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)miR-203可通過靶向調(diào)控RUNX2進而抑制牙周膜干細胞成骨向分化能力［7］。然而炎癥狀態(tài)下miR-203對hPDLSCs成骨向分化的影響及其作用機制尚不明確。研究證實miR-203通過抑制TNFα及IL-24促炎因子的表達，從而抑制皮膚免疫反應(yīng)［8］，表明在細胞分化過程中TNFα和miRNA之間存在潛在調(diào)控關(guān)系。因此，我們推測miR-203可能通過調(diào)控TNFα參與炎癥狀態(tài)下hPDLSCs的成骨分化。本研究將探索miR-203在炎癥微環(huán)境下對PDLSCs成骨向分化能力的影響及其機制，以期為牙周炎骨缺損提供新的機制和潛在的治療靶點。

1.材料和方法

1.1 實驗材料 胎牛血清（Gibco，美國）；胰蛋白酶（Hyclone，美國）；TNFα（Peprotech，美國）；α-MEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；低溫高速離心機（Eppendorf，德國)，酶聯(lián)免疫檢測儀（BIO-TEK，美國）；離心機（Eppendorf，德國）；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C(Sigma，美國)，RUNX2、ALP、OCN、OPN、TNFα及β-actin引物（生工，中國)，cDNA合成試劑盒、SYBR Green試劑盒（Takara，日本)；miR-203 mimics、miR-203 inhibitor(銳博，中國)；Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國）；TNFα ELISA試劑盒（碧云天，中國）；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（碧云天，中國）。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及礦化誘導(dǎo) 收集口腔頜面外科18-24歲志愿者即刻拔除的前磨牙或第三磨牙，要求牙齒健康完整，拔除牙齒在無菌條件下充分沖洗，并用手術(shù)刀片分離出牙齒根中段牙周膜組織，加入500μL濃度為4mg/L的Ⅰ型膠原酶37℃消化45min，每15min重懸一次，用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液）重懸并接種于6孔板中，于細胞培養(yǎng)孵箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞長至80%融合率時，有限稀釋法挑選細胞單克隆株，傳代擴大培養(yǎng)后用于后續(xù)實驗。細胞饑餓培養(yǎng)12h后，按照預(yù)實驗得到的病毒滴度與細胞比例加入病例液（MOI=10），12h后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，并通過qPCR鑒定轉(zhuǎn)染效率。

取P3代hPDLSCs消化、計數(shù)，以1.5×105個/孔的細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，分為礦化誘導(dǎo)組和對照組（未礦化誘導(dǎo)組)，待細胞長至80%融合率時，更換為成骨誘導(dǎo)液（完全培養(yǎng)基、50mg/L維生素C、10nmol/L地塞米松和10mmol/L β-甘油磷酸鈉），誘導(dǎo)2周后通過qRCR檢測TNFα及成骨相關(guān)基因表達。

1.3 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRCR）檢測mRNA的表達 取P3代hPDLSCs消化、計數(shù)，以1.5×105個/孔的細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞長至80%融合率時，更換為成骨誘導(dǎo)液，并添加TNFα和miR-203作為刺激因素，實驗分為TNFα組（20ng/ml）、對 照 組、TNFα+miR-203組 及TNFα+miR-203 inhibitor組培養(yǎng)2周后，提取細胞總RNA，按照Prime Script?RT reagent Kit（Takara生物公司，日本）說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

q-PCR反應(yīng)根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM（Takara生物公司，日本）說明書操作，miR?203上游引物為：5′-GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG-3′，下游引物為：5′-CCAGUGGUUCUUAACAGUUCAAC-3′；內(nèi)參U6上游引物為：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 引 物 為：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TNFα上游引物為：5′-CCGGGCAACAATGTCCAAAAG-3′，下游引物為：5′-AGGACGACTGTTCAGCACG-3′；RUNX2上游 引 物 為：5′-GGGTAAGACTGGTCATAGGACC-3′，下游引物為：5′-CCCAGTATGAGAGTAGGTGTCC-3′；OCN上游 引物為：5′-GCCGAGGTGATAGTGTGGTT-3′，下 游 引 物 為：5′-ACTCCTCGCTTTCCATGTGT-3′；ALP上游引物為：5′-CCCACCTCAGGCTATGCTA-3′，下游引物為：5′-CACTGGGCAGACAGTCAGAA-3′；內(nèi)參β?actin上 游 引 物 為：5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′，下游引物為：5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′。

1.4 茜素紅檢測miR-203及TNFα對hPDLSCs成骨分化能力的影響 取P3代hPDLSCs消化、計數(shù)，以1.5×105個/孔的細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞長至80%融合率時，更換為成骨誘導(dǎo)液，并分為TNFα組（20ng/ml）、對照組、TNFα+miR-203組及TNFα+miR-203 inhibitor組，誘導(dǎo)2周后進行茜素紅染色：PBS輕柔漂洗細胞3次，棄PBS后加入4%的多聚甲醛固定細胞20min；棄多聚甲醛固定液，PBS輕柔漂洗細胞3次，棄PBS后加入茜素紅染液染色10min；PBS洗去殘留的茜素紅染液，顯微鏡下觀察并記錄鈣化結(jié)節(jié)的形成；加入10%氯化十六烷基吡啶孵育15min，充分釋放出染色的茜素紅，酶標儀檢測各組562nm處的OD值，以O(shè)D值作茜素紅染色定量分析。

1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀰⒄誏ipofectamine 2000（Invitrogen，美國）說明書對hPDLSCs進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染篩選后48h后用于后續(xù)實驗。利用生物信息學預(yù)測發(fā)現(xiàn)TNFα為miR-203的潛在靶基因，為確定miR-203靶向結(jié)合于TNFα的3′UTR區(qū)，將TNFα突變型（TNFα-MUT）和野生型（TNFα-WT）3′UTR合成，并連接到psiCHENK-2載體質(zhì)粒。在hPDLSCs中共轉(zhuǎn)染miR-203 mimics、miR-203-NC和TNFα質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后冰上裂解細胞，檢測螢火蟲和海腎熒光素酶熒光強度并進行分析。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA實驗）按照ELISA試劑盒（碧云天，中國）說明書步驟檢測TNFα組（20ng/ml）、對照組、TNFα+miR-203組及TNFα+miR-203 inhibitor組細胞上清液中TNFα水平，TNFα因子被固相捕獲后通過酶標儀檢測450nm處的吸光度值，繪制標準曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出靶蛋白濃度。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用Graph 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗或one-way ANOVA單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。通過樣品的吸光度值和標準曲線計算出樣品的相應(yīng)濃度。

2.結(jié)果

2.1 牙周膜干細胞分化前后TNFα和成骨相關(guān)基因的表達 原代培養(yǎng)的細胞呈長梭形，圍繞組織塊呈放射狀排列（1A）；通過茜素紅染色對牙周膜干細胞礦化能力進行鑒定（1B）；qPCR檢測hPDLSCs分化前后TNFα和成骨基因mRNA的表達水平，結(jié)果顯示：hPDLSCs分化后TNFα的表達水平與對照組相比顯著下調(diào)（圖1C），而RUNX2、ALP、OCN、OPN的表達水平則明顯升高（圖1D），差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 牙周膜干細胞礦化誘導(dǎo)后TNFα和成骨相關(guān)基因的表達（×10)

2.2 TNFα對牙周膜干細胞成骨分化能力及miR-203影響TNFα（20ng/ml）刺激牙周膜干細胞后通過茜素紅染色及qPCR檢測細胞成骨分化和miR?203表達情況，qPCR結(jié)果顯示TNFα刺激后牙周膜干細胞中成骨相關(guān)基因RUNX2、ALP、OPN、OCN mRNA的表達水平顯著下調(diào)，而miR?203的表達則明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)(圖2)。茜素紅結(jié)果顯示TNFα刺激后牙周膜干細胞中的礦化結(jié)節(jié)比對照組明顯較少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)(圖2)。

圖2 TNFα抑制牙周膜干細胞成骨分化并上調(diào)miR-203的表達（×10)

2.3 miR-203 inhibitor逆轉(zhuǎn)TNFα對牙周膜干細胞成骨能力的抑制作用miR-203轉(zhuǎn)染牙周膜干細胞48h后可見細胞表達綠色熒光蛋白（圖3A）。qPCR驗證牙周膜干細胞轉(zhuǎn)染qPCR驗證牙周膜干細胞轉(zhuǎn)染miR-203 inhibitor和miR-203 mimics效果，結(jié)果顯示miR-203 mimics組中miR?203的表達顯著增加，而miR-203 inhibitor組結(jié)果相反，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)(圖3B)。TNFα刺激牙周膜干細胞并轉(zhuǎn)染miR-203后礦化誘導(dǎo)2周，結(jié)果顯示TNFα對牙周膜干細胞成骨能力有明顯抑制作用，而miR-203 inhibitor組則可逆轉(zhuǎn)TNFα對牙周膜干細胞成骨能力的抑制作用，而miR-203 mimics組則進一步抑制牙周膜干細胞成骨能力，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)(圖3C-E)。

圖3 miR-203 inhibitor可逆轉(zhuǎn)TNFα對牙周膜干細胞成骨能力的抑制作用（×10)

2.4 TNFα為miR-203的靶基因 通過生物信息學網(wǎng)站預(yù)測TNFα為miR-203的潛在靶基因，miR-203轉(zhuǎn)染后通過qPCR及ELISA實驗檢測hPDLSCs中TNFα水平，結(jié)果顯示miR-203 mimics組中的TNFα mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組，而miR-203 inhibitor則結(jié)果相反（圖4），說明TNFα可被miR-203負向調(diào)控。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示TNFα-WT+miR-203組的熒光比值顯著低于TNFα-WT+miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義（圖4）(P＜0.05)；而TNFα-MUT+miR-203組和TNFα-MUT+miR-NC組的熒光比值相比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。結(jié)果進一步確認TNFα是miR-203的靶基因，表明miR-203可與TNFα的3′-UTR區(qū)上的位點結(jié)合，并直接負向調(diào)控TNFα基因。

圖4 雙熒光素酶報告驗證TNFα為miR-203靶基因

3.討論

牙周炎發(fā)病過程中，炎癥不僅影響骨吸收和破骨細胞活性，而且還會抑制牙周膜干細胞形成新的牙周結(jié)締組織牙槽骨的能力［9］。研究表明炎性微環(huán)境可能導(dǎo)致干細胞功能缺失［10］。因此，PDLSCs成骨分化能力降低可能與牙周炎的發(fā)病機制有關(guān)［11］。研究發(fā)現(xiàn)與正常PDLSCs相比，炎癥來源的PDLSCs多向分化能力明顯減弱［2］。但炎癥微環(huán)境下PDLSCs分化能力降低的機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)miR-203負向調(diào)節(jié)TNFα及白細胞介素-24(IL24）等關(guān)鍵細胞促炎因子，進而抑制皮膚免疫反應(yīng)。而我們前期研究表明抑制miR-203表達后可促進牙周膜干細胞成骨向分化，此外我們還發(fā)現(xiàn)miR-203可與RUNX2的3′-UTR區(qū)上的位點結(jié)合，表明miR-203與RUNX2存在直接負向調(diào)控關(guān)系。而RUNX2作為一種成骨向分化特異性轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控眾多與成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［12］。因此，我們推斷miR-203在炎癥微環(huán)境下調(diào)控PDLSCs成骨向分化發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

決定細胞命運相關(guān)的分子機制包括特定的信號通路和特定的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子被細胞外信號順序激活。而在決定細胞命運的過程中，miRNAs是信號網(wǎng)絡(luò)和基因重編程不可或缺的調(diào)節(jié)因子。研究表明miRNAs是介導(dǎo)細胞分化的調(diào)節(jié)因子，靶向調(diào)控這些miRNAs可能是治療炎癥性疾病的一種十分具有前景的方法［13］。牙周炎作為一種慢性炎癥環(huán)境，我們預(yù)測它可能具有與正常生理狀態(tài)不同的miRNA表達譜。基于這一假設(shè)，我們檢測了hPDLSCs成骨分化過程中差異表達的miRNAs。結(jié)果顯示，正常情況下hPDLSCs在成骨分化過程中，miR-203及miR-124表達明顯上調(diào)［7，14］。而本研究發(fā)現(xiàn)在TNFα誘導(dǎo)的炎性微環(huán)境下，miR-203在hPDLSCs成骨分化過程中表達水平上調(diào)，提示miR-203可能在炎癥微環(huán)境下具有調(diào)控PDLSCs成骨分化的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)TNFα是導(dǎo)致牙周炎的主要細胞因子之一，TNFα水平的升高被證實與牙周病的嚴重程度和免疫反應(yīng)有關(guān)［15］。TNFα可通過抑制骨形成和促進骨吸收促進牙周炎的發(fā)生［16］。然而，也有報道稱TNFα能促進人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化，并證明TNFα通過增強肌肉源性基質(zhì)細胞的募集和分化促進骨折修復(fù)［17］。因此，TNFα在干細胞成骨分化中的作用是復(fù)雜的、雙相的。大量研究顯示TNFα體外刺激牙周膜干細胞的濃度在10-100ng/ml之間，多數(shù)文獻選擇的刺激濃度是10-20ng/ml［16，18，19］。本實驗通過預(yù)實驗檢測了0、10、20、50、100ng/ml TNFα對牙周膜干細胞中成骨相關(guān)基因的影響，發(fā)現(xiàn)20ng/ml TNFα可顯著下調(diào)成骨基因，故本實驗選擇了20ng/ml作為刺激濃度。為研究miR-203調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境下PDLSC成骨分化潛在的分子機制，我們尋找與miR-203相關(guān)的潛在成骨目標基因，發(fā)現(xiàn)miR-203可靶向調(diào)控Runx2進而抑制牙周膜干細胞成骨向分化［7］。此外，我們還發(fā)現(xiàn)TNFα也可被miR-203靶向調(diào)控，結(jié)果與文獻報道相一致［8］。值得注意的是，miR-203在PDLSCs炎癥微環(huán)境中顯著上調(diào)，而高表達miR-203則抑制TNFα的產(chǎn)生，從而形成了miR-203-TNFα負反饋循環(huán)。此外，雙熒光素酶報告實驗證實TNFα含有miR-203結(jié)合位點，該位點位于3′-UTR中并與miR-203序列互補，這意味著miR-203可靶向TNFα進而調(diào)控PDLSCs的成骨向分化。

本研究首次探索了炎癥微環(huán)境下miR-203對hPDLSCs成骨分化能力的影響，研究結(jié)果顯示TNFα刺激下可上調(diào)hPDLSCs中miR-203的表達并抑制hPDLSCs的成骨分化能力，兩者的表達呈負相關(guān)。此外，在TNFα誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境下抑制miR-203的表達可逆轉(zhuǎn)TNFα對hPDLSCs成骨向分化的抑制作用。雙熒光素酶報告實驗進一步證實TNFα是hPDLSCs中miR-203的直接靶點。miR-203可以直接靶向TNFα負向調(diào)控PDLSCs成骨向分化。值得注意的是，在炎癥環(huán)境中TNFα可以通過靶向miR-203形成負反饋循環(huán)，從而抑制PDLSC的成骨向分化。這些結(jié)果提示miR-203/TNFα功能軸形成的負反饋環(huán)路在炎癥微環(huán)境下hPDLSC的成骨分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。綜上，本研究證實了在炎癥微環(huán)境下TNFα通過靶向miR-203負向調(diào)控hPDLSCs的成骨向分化能力，提示miR-203具有重建牙周炎損傷的牙周組織的潛力，研究為牙周炎和其他炎癥性疾病的治療策略提供分子基礎(chǔ)。