miR-92a、ACE在冠心病合并2型糖尿病患者血清中的表達(dá)及其預(yù)后相關(guān)性

張威，許浩，余琴

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心病，CHD），是冠狀動(dòng)脈（冠脈）血管處發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變引起血管腔阻塞或狹窄，進(jìn)而引發(fā)心肌缺氧、缺血、壞死等心臟類慢性發(fā)展疾病[1]。糖尿病（DM）是由遺傳、環(huán)境等因素引起的代謝性疾病，以高血糖為主要特征，常伴血管、心臟、神經(jīng)等器官的功能性障礙[2]，2型糖尿?。═2DM）占總糖尿病患者的90%以上，資料顯示我國(guó)糖尿病患病率較高，由其引發(fā)的心血管疾病、神經(jīng)病變等并發(fā)癥對(duì)社會(huì)及家庭造成沉重負(fù)擔(dān)[3]，CHD是T2DM患者的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，二者相互影響、相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。CHD合并T2DM患者主要有高血脂、高血壓、肥胖、體力不支等特點(diǎn)[4]。近年來(lái)CHD合并T2DM發(fā)病人數(shù)逐年升高，致死率及致殘率較高，預(yù)防和根治CHD合并T2DM的藥物也尚未上市，關(guān)于CHD合并T2DM不良預(yù)后的研究較少。miRNA是一類可以參與血管生成、細(xì)胞增殖分化等生理過(guò)程的非編碼單鏈RNA分子，與糖尿病存在一定關(guān)系[5]，研究發(fā)現(xiàn)miR-92a在T2DM患者體內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)，具有很好的疾病評(píng)估價(jià)值[6]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）是腎素-血管緊張-醛固酮系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，具有催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ、調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等作用，對(duì)高血壓、糖尿病等疾病的治療和預(yù)后具有重要作用[7]。本研究通過(guò)對(duì)CHD合并T2DM患者血清中miR-92a、ACE的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定和分析，為CHD合并T2DM的不良預(yù)后提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組選擇2017年4月至2018年4月于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院確診的CHD患者205例，其中男性107例，女性98例，年齡43～77歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：CHD的確診根據(jù)冠心病分級(jí)指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，冠脈造影時(shí)左主干、右冠、前降支、回旋支主干或其主要分支血管狹窄程度≥50%；T2DM的確診根據(jù)世界衛(wèi)生組織1999年的診斷標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦等癥狀，空腹血糖≥7.0 mmol/L、隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L；入院主訴為胸悶、心悸等不良癥狀，心電圖、心臟彩超等檢查異常；入院后接受冠狀動(dòng)脈造影術(shù)等。排除標(biāo)準(zhǔn)：有腫瘤、急性炎癥、感染性疾病等；肝功能受損嚴(yán)重者；難治性高血壓。根據(jù)是否合并T2DM分為CHD合并T2DM組（100例）、CHD組（105例）。選取同期本院健康體檢者115例為對(duì)照組，其中男性59例，女性56例，年齡46～75（63.81±13.80）歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理采集CHD合并T2DM、CHD患者入院24 h及正常體檢者空腹外周血3～5 ml，室溫靜置20 min，3000轉(zhuǎn) 4℃離心10 min，收集血清至特定離心管中，于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA的提取和相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 qRT-PCR法檢測(cè)血清miR-92a的表達(dá)水平利用RNA提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）的要求提取血清總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TAKARA公司）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qRTPCR）（美國(guó)Bio-Rad公司）對(duì)miR-92a進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系共20 μl：miScript SYBR? Green Mix 10 μl，cDNA（50 ng/μl）2 μl，上下游引物（10 μM）各1 μl，ddH2O 6.0 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s；95℃變性30 s；62℃退火延伸30 s；72℃延伸15 s；共40個(gè)循環(huán)。miR-92a及內(nèi)參U6的引物序列見(jiàn)表1。采用2-△△CT法對(duì)血清miR-92a表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 ELISA法檢測(cè)血清ACE表達(dá)水平取待測(cè)血清稀釋液10 μl，加入酶標(biāo)板中，經(jīng)過(guò)37℃溫育、洗滌液洗滌、加酶、溫育、顯色、終止顯色等步驟后于450 nm處測(cè)定樣品吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清ACE表達(dá)水平，具體操作步驟按照ELISA試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）中的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 受試者臨床指標(biāo)的測(cè)定采用AU5800全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）測(cè)定血清中三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖（GLU）、糖化血紅蛋白（GHb）水平。

1.2.5 預(yù)后對(duì)患者進(jìn)行為期1年的隨訪，觀察起點(diǎn)為出院日，觀察終點(diǎn)為心血管不良事件發(fā)生，主要有全因死亡、非致死性心肌梗死、靶病變血運(yùn)重建、復(fù)發(fā)心絞痛等，記錄發(fā)生心血管不良事件的患者例數(shù)。隨訪截止日期為2019年4月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，三組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。ROC法比較miR-92a、ACE以及二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)CHD合并T2DM的診斷價(jià)值，曲線下面積（AUC）比較采用U檢驗(yàn)；CHD合并T2DM不良預(yù)后的影響因素采用Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較三組受試者年齡、性別、BMI間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組相比，CHD組、CHD合并T2DM組患者血清中TG、HDL-C水平均顯著升高（P＜0.05），其中CHD組與CHD合并T2DM組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組相比，CHD合并T2DM組患者血清中GLU、GHb水平顯著升高，CHD組與對(duì)照組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表2。

表2 兩組患者一般臨床資料比較

2.2 三組患者血清miR-92a、ACE mRNA表達(dá)水平比較對(duì)照組、CHD組、CHD合并T2DM組患者血清miR-92a mRNA表達(dá)水平分別為0.98±0.25、1.25±0.32、1.88±0.51；血清ACE表達(dá)水平分別為（32.97±6.25）U/L、（43.01±9.76）U/L、（46.97±11.20）U/L；與對(duì)照組比較，CHD組及CHD合并T2DM組患者血清的miR-92a表達(dá)水平和ACE表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），其中CHD合并T2DM組的表達(dá)水平高于CHD組，表3。

表3 三組患者血清miR-92a、ACE mRNA表達(dá)水平比較

2.3 預(yù)后良好與預(yù)后不良CHD合并T2DM患者間指標(biāo)比較對(duì)CHD合并T2DM組患者進(jìn)行隨訪1年，發(fā)生心血管不良事件（預(yù)后不良組）33例，預(yù)后良好組67例，預(yù)后不良發(fā)生率為33%，預(yù)后良好組與預(yù)后不良組性別、年齡、BMI指數(shù)、TC水平之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組患者血清中TG、HDL-C、GLU、GHb、miR-92a表達(dá)水平和ACE表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），表4。

表4 預(yù)后良好與預(yù)后不良CHD合并T2DM患者間指標(biāo)比較

2.4 血清miR-92a、ACE表達(dá)水平對(duì)CHD合并T2DM患者不良預(yù)后的診斷價(jià)值ROC曲線結(jié)果表明，血清miR-92a表達(dá)水平診斷CHD合并T2DM不良預(yù)后曲線下面積（AUC）為0.776（95%CI：0.675～0.873），敏感度為72.7%，特異性為79.1%，截?cái)嘀禐?.650；血清ACE表達(dá)水平診斷CHD合并T2DM不良預(yù)后的AUC為0.782（95%CI：0.691～0.873），敏感度為75.8%，特異性為76.1%，截?cái)嘀禐?6.62 U/L；聯(lián)合分析AUC為0.836（95%CI：0.759～0.912），敏感度為84.8%，特異性為71.6%；二者聯(lián)合檢測(cè)并未顯著提高對(duì)ARDS患者不良預(yù)后的診斷價(jià)值（P＞0.05），表5，圖1。

圖1 血清miR-92a、ACE表達(dá)水平對(duì)CHD合并T2DM患者不良預(yù)后的診斷價(jià)值ROC圖

表5 血清miR-92a、ACE表達(dá)水平對(duì)CHD合并T2DM不良預(yù)后的診斷價(jià)值

2.5 Logistic回歸分析CHD合并T2DM不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素將CHD合并T2DM患者是否發(fā)生預(yù)后不良作為因變量，以血清中TG、LDL-C、GLU、GHb、miR-92a、ACE表達(dá)水平作為水平自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血清中miR-92a、ACE水平的升高是CHD合并T2DM不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），血清中TG、LDL-C、GLU、GHb為CHD合并T2DM患者預(yù)后不良的無(wú)關(guān)因素（P＞0.05），表6。

表6 CHD合并T2DM不良預(yù)后發(fā)生的多因素分析

3 討論

T2DM是一種常見(jiàn)的慢性炎癥和代謝類疾病，是誘發(fā)心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一，可通過(guò)葡萄糖毒性、脂肪毒性、炎癥介質(zhì)等途徑損害心血管功能，其中較高比例的DM患者死于心血管疾病，資料顯示冠心?。–HD）是T2DM主要并發(fā)癥之一[9]。隨著現(xiàn)代生活方式的改變，我國(guó)CHD合并T2DM患者越來(lái)越多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)目前有8000萬(wàn)人患CHD合并T2DM[10]。長(zhǎng)期患CHD合并T2DM會(huì)造成重要臟器的功能性障礙，出現(xiàn)心動(dòng)過(guò)速、胃輕癱、膀胱排空困難、便秘、腹瀉等一系列交替復(fù)發(fā)的臨床癥狀，且病死率較高[11]。隨著醫(yī)療科技手段的不斷進(jìn)步，關(guān)于CHD合并T2DM的臨床治療手段取得很大的進(jìn)展，但是關(guān)于CHD合并T2DM不良預(yù)后的研究較少，因此尋找與CHD合并T2DM有關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)于CHD合并T2DM的病情及不良預(yù)后的診斷具有重要意義。

miRNA是一類進(jìn)化保守的短序列小RNA，具有多種生物學(xué)功能，miR-92a在促進(jìn)血管的生長(zhǎng)及恢復(fù)損傷組織功能方面具有一定的調(diào)控作用，在冠心病等心血管疾病中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)miR-92a在穩(wěn)定型CHD合并T2DM患者血清中呈現(xiàn)高表達(dá)[12,13]。ACE又稱激肽酶，廣泛存在于人體各組織中，與動(dòng)脈粥樣硬化CHD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)ACE在CHD、糖尿病等疾病中呈現(xiàn)高表達(dá)，推測(cè)二者可能對(duì)CHD疾病具有一定的預(yù)測(cè)及診斷價(jià)值[14,15]，探究血清中miR-92a、ACE表達(dá)水平對(duì)CHD合并T2DM不良預(yù)后的診斷價(jià)值具有重要意義，本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CHD組及CHD合并T2DM組患者血清中miR-92a表達(dá)水平和ACE表達(dá)水平均顯著升高，與相關(guān)研究一致，表明miR-92a和ACE表達(dá)水平與CHD及T2DM病情間存在一定聯(lián)系，但二者與不良預(yù)后間的關(guān)系仍不清楚。

資料顯示TG、LDL-C、GLU、GHb等指標(biāo)能反應(yīng)人體血脂、血糖代謝水平，研究發(fā)現(xiàn)在CHD合并T2DM病情惡化患者體內(nèi)這些指標(biāo)數(shù)值較高，可能與患者的病情具有一定的關(guān)系[16]，本研究結(jié)果顯示，與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組患者血清中TG、LDL-C、GLU、GHb、miR-92a表達(dá)水平和ACE表達(dá)水平均顯著較高，提示血清miR-92a及ACE與CHD合并T2DM患者的血脂、血糖代謝水平密切相關(guān)，其水平異常升高可能預(yù)示不良預(yù)后的發(fā)生，可能與miR-92a、ACE對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病具有不利影響有關(guān)，miR-92a通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子KLF2、血栓調(diào)節(jié)蛋白及一氧化氮合酶的表達(dá)發(fā)揮作用[13]，而ACE表達(dá)水平的增加會(huì)對(duì)心血管產(chǎn)生不利影響，主要通過(guò)促進(jìn)血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，引起醛固酮水平升高，進(jìn)而引發(fā)動(dòng)脈高壓、心臟纖維化、心臟舒張功能障礙等不良癥狀[14,15]。ROC曲線及Logistic回歸分析進(jìn)一步說(shuō)明，血清中miR-92a及ACE表達(dá)水平升高是CHD合并T2DM患者不良預(yù)后發(fā)生的危險(xiǎn)因素，診斷CHD合并T2DM不良預(yù)后的敏感度和特異性較高，當(dāng)CHD合并T2DM患者血清中miR-92a表達(dá)水平大于1.650，ACE值大于46.62 U/L時(shí)，患者發(fā)生不良預(yù)后的可能較大，需盡早采取措施預(yù)防不良事件的發(fā)生，此外二者聯(lián)合檢測(cè)并未顯著提高對(duì)CHD合并T2DM患者不良預(yù)后的診斷價(jià)值。

綜上所述，血清中miR-92a及ACE表達(dá)水平的升高與CHD合并T2DM的發(fā)病及不良預(yù)后聯(lián)系密切，并對(duì)CHD合并T2DM不良預(yù)后具有一定的診斷價(jià)值。關(guān)于miR-92a及ACE在CHD合并T2DM中表達(dá)異常的具體機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究。