Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108的制備及初步生物學(xué)評價(jià)

高 菲 董瑞林 宋志浩 張?zhí)N瀚 陳孟毅 邱珊珊 王成龍 許 林 成偉華

（原子高科股份有限公司 北京102413）

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（Neuroendocrine Tumors，NETs）是一類起源于不同神經(jīng)內(nèi)分泌器官的一組異質(zhì)性腫瘤，主要以胃、腸和胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤多見，發(fā)病率約為十萬分之七［1-3］。NETs的罕見性和無癥狀的臨床過程使得漏診和誤診率高，近60%的患者在初診時(shí)發(fā)現(xiàn)已處于晚期［4］。生長抑素受體（Somatostatin Receptor，SSTR）為七螺旋G蛋白偶聯(lián)糖蛋白跨膜受體，有5種不同的分子亞型［5］，研究表明高達(dá)94%的NETs細(xì)胞表面有SSTR的高表達(dá)，甚至一些低分化的腫瘤細(xì)胞中也有SSTR的表達(dá)。SSTR成為診斷和治療NETs并進(jìn)行治療的重要靶點(diǎn)。

從20世紀(jì)80年代至今，已經(jīng)報(bào)道并評估了許多放射性標(biāo)記的SSTR靶向分子探針［6-9］。其中奧曲肽作為一種人工合成的生長抑素類似物，因其理想的代謝半衰期，使得放射性核素標(biāo)記的奧曲肽及其類似物的研究成為熱點(diǎn)。例如，采用治療核素放射性標(biāo)記的SSTR激動(dòng)劑（如90Y-或177Lu-DOTATOC和177Lu-DOTATATE），可進(jìn)行肽受體放射性核素治療（Peptide Receptor Radionuclide Therapy，PRRT）［10］，以及用于正電子發(fā)射斷層顯像（Positron Emission Tomography，PET）的68Ga標(biāo)記的SSTR激動(dòng) 劑68Ga-DOTATOC［11］、68Ga-DOTANOC和68Ga-DOTATATE［12］，可對神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤進(jìn)行顯像定位。SSTR-PET/CT在檢測原發(fā)性腫瘤、未知原發(fā)性腫瘤、分期、再灌注和評估NETs患者的治療反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用，18F標(biāo)記的多肽類似物也成為熱門的研究方向。

與其他放射性核素相比，18F核素產(chǎn)生的正電子能量較低，最高只有0.635 MeV，平均為0.25 MeV，其在組織中湮滅距離短（約2.4 mm），具有合適的半衰期（t1/2=109.8 min），可以得到高分辨率的圖像，因此成為臨床應(yīng)用最廣泛、最理想的PET顯像核素。Schottelius等［13］報(bào) 道 的Cel-S-Dpr（［18F］FBOA）TOCA展現(xiàn)出良好的藥代動(dòng)力學(xué)和較高的腫瘤與背景比值，并且首次在患者研究中證實(shí)了PET成像潛力，然而較低標(biāo)記效率限制18F-肽標(biāo)記在臨床上的應(yīng)用。之后，Wester等［14］報(bào)道18F-FP-Gluc-TOCA展現(xiàn)出較高的腫瘤特異性和較好的對比度，成為SSTR陽性腫瘤PET成像示蹤劑，并應(yīng)用于臨床，但由于標(biāo)記過程繁瑣，很大程度上影響臨床使用。William、江大衛(wèi)、李葆元等［15-18］發(fā)表的Al18F復(fù)合物偶聯(lián)雙功能螯合劑（NOTA、DOTA等）標(biāo)記方法的應(yīng)用很大程度上推動(dòng)18F標(biāo)記多肽類正電子藥物的進(jìn)展，該方法標(biāo)記簡單、快速，可在水環(huán)境中實(shí)現(xiàn)18F核素的標(biāo)記。溫凱、郭飛虎等［19-20］研究糖基化奧曲肽衍生物18FTa-Gluc-TOCA以 及n-Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-TOCA探針，水溶性好，體內(nèi)外穩(wěn)定。通過生物分布實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在生長抑素受體高表達(dá)的胰腺中有一定的攝取，其中18F-Ta-Gluc-TOCA在腫瘤內(nèi)保留時(shí)間較長，有望用于生長抑素受體陽性腫瘤PET顯像劑。近期，美國國立衛(wèi)生研究院生物醫(yī)學(xué)影像與生物工程研究所陳小元教授實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合廈門大學(xué)分子影像暨轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心以RGD2為靶向分子、PEG4為連接基團(tuán)偶聯(lián)NOTA后，通過Al18F標(biāo)記，先后開發(fā)出氟［18F］阿法和18F-阿法肽（18F-AlfatideⅡ）。與世界同類產(chǎn)品相比，氟［18F］阿法肽不僅有親和力高、非靶本底清除速度較快，而且穩(wěn)定性好、標(biāo)記過程簡單易于操作［21］。2018年，中國國家藥品監(jiān)督管理局授予18F-AlfatideⅡ臨床試驗(yàn)批件，成為國內(nèi)首個(gè)獲批的正電子放射性一類新藥。這進(jìn)一步表明Al18F標(biāo)記方法標(biāo)記多肽是具有良好應(yīng)用前景。

KE108多肽作為生長抑素類似物，具有和奧曲肽相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且在對5種不同亞型受體都具有較高的親和力（表1），對于SSTR陽性腫瘤具有廣譜性［23］。研究發(fā)現(xiàn)，奧曲肽的糖基化可降低多肽的親脂性和肝膽代謝，優(yōu)化體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)［24］。2016年，張健等采用99Tcm間接標(biāo)記的方法，利用雙功能螯合劑（Hydrazinonicotinamide，HYNIC），分別以Tricine［三（羥甲基）甲基甘氨酸］和乙二胺-N，N-二乙酸為協(xié)同配體對多肽KE108進(jìn)行標(biāo)記99Tcm［25］。優(yōu)化之后的標(biāo)記率90%以上，標(biāo)記物99Tcm-HYNICKE108在腫瘤組織中有較好攝取率，并且給藥后1 h內(nèi)腫瘤顯像較為清晰，說明KE108多肽對生長抑素受體具有一定的靶向性和親和力。

表1 生長抑素及其類似物對SSTR不同亞型的親和力（IC50/nmol·L-1）Table 1 Binding affinity of somatostatin and its analogues to all sst subtypes(IC50/nmol·L-1)

本研究通過對KE108多肽進(jìn)行化學(xué)修飾，設(shè)計(jì)并制備了一種新型通過偶聯(lián)雙功能螯合劑NOTA的糖基化生長抑素類似物，通過標(biāo)記18F核素得到Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108以靶向SSTR陽性腫瘤，分別在體內(nèi)外進(jìn)行生物學(xué)評價(jià)，評估其用于SSTR陽性腫瘤早期診斷的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ECLIPSE HP型回旋加速器（德國Siemens公司）；PET/CT（比利時(shí)Molecube公司）；自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀（Perkinelmer Wallac公司）；ESI-MS質(zhì)譜儀（美國Capintec公司）；MH-2800加熱模塊；活度計(jì)CRC-15；CBN-20A高效液相儀（日本Shimadzu公司）；色譜柱Agilent ZORBAX XDB-C18，5μm，4.6 mm×250 mm；GABI型放射性檢測器（德國Raytest公司）。

Fmoc-Phe-CTC Resin、O-苯并三氮唑-四甲基脲六 氟 磷 酸 鹽（O-Benzotriazole-N，N，N'，N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate，HBTU）、N-甲基嗎啉（4-Methylmorpholine，NMM）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-Ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride，EDC·HCl）、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Glucose-Lys（Fmoc）-OH、NOTA（OtBu）、鈀碳（Pd/C）、哌啶（Piperidine，Pip）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）、六 氟 異 丙 醇（Hexafluoroisopropanol，HFIP）、二 氯 甲 烷（Dichloromethane，DCM）、甲 醇、乙 二 硫 醇（Ethanedithiol，EDT）、冰 乙 醚、三 氟 乙 酸（Trifluoroacetic acid，TFA）、1-羥基苯并三唑（NHydroxybenzotrizole，HOBT）、乙腈、六水合三氯化鋁（百靈威科技有限公司）；H218O（江蘇華益科技有限公司）；龍膽酸（阿拉?。?。

1.2 多肽合成

Gluc-Lys（NOTA）-KE108結(jié)構(gòu)及其合成路線見圖1和圖2。稱量0.3 mmol·g-1的Fmoc-Phe-CTC Resin 5 g，20%Pip/DMF脫保護(hù)30 min，之后按當(dāng)量比例（AA:HBTU:NMM=3:2.85:6）投入原料，加入適量DMF，鼓氮?dú)夥磻?yīng)30 min，通過茚三酮檢測反應(yīng)完全，用DMF、DCM、甲醇依次洗滌；重復(fù)上述步驟，得 到Fmoc-Dab-Arg（NO2）-Phe-Phe-Trp（Boc）-Lys-Thr（tBu）-Phe-CTC Resin（樹脂肽）。將樹脂肽置于30%HFIP/DCM中，搖床控溫1 h，抽濾收集濾液，旋蒸濃縮得到粗品Fmoc-Dab-Arg（NO2）-Phe-Phe-Trp（Boc）-Lys-Thr（tBu）-Phe-OH（1）。

圖1 Gluc-Lys(NOTA)-KE108的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Gluc-Lys(NOTA)-KE108

圖2 Gluc-Lys(NOTA)-KE108的合成路線Fig.2 Synthetic route of Gluc-Lys(NOTA)-KE108

將1溶解于DCM中，分別加入EDC·HCl、HOBT（1.2當(dāng)量）和NMM（2當(dāng)量），攪拌反應(yīng)過夜，旋蒸濃縮得到環(huán)化后的粗品Cyclo（Fmoc-Dab-Arg（NO2）-Phe-Phe-Trp（Boc）-Lys-Thr（tBu）-Phe）（2）。

將2溶解于20%Pip/DMF中，攪拌反應(yīng)1 h，濃縮，然后依次加入1.1當(dāng)量的Fmoc-Tyr（tBu）-OH溶解于DMF中，之后添加EDC·HCl、HOBT（1.2當(dāng)量）和NMM（2當(dāng)量），之后用20%Pip/DMF處理1 h，濃縮后得到粗品Tyr（tBu）-Cyclo（H-Dab-Arg（NO2）-Phe-Phe-Trp（Boc）-Lys-Thr（tBu）-Phe）（3）。

重復(fù)上述步驟，連接Glucose-Lys（Fmoc）-OH得到粗產(chǎn)品Gluc-Lys-H-Tyr（tBu）-Cyclo（H-Dab-Arg（NO2）-Phe-Phe-Trp（Boc）-LysThr（tBu）-Phe）（4）。

重復(fù)上述步驟，繼續(xù)連接NOTA（OtBu）得到粗品Gluc-Lys-（NOTA（OtBu））-H-Tyr（tBu）-Cyclo（HDab-Arg（NO2）-Phe-Phe-Trp（Boc）-Lys-Thr（tBu）-Phe）（5）。

將5溶解于甲醇中，加入Pd/C氫化后得到粗品Gluc-Lys（NOTA（OtBu））-H-Tyr（tBu）-Cyclo（H-Dab-Arg-Phe-Phe-Trp（Boc）-Lys-Thr（tBu）-Phe）（6）。

將6溶解于TFA/EDT/H2O=95/2.5/2.5切割液，搖床控溫3 h，抽濾，收集濾液后加入6倍體積冰乙醚，離心沉淀收集固體，將沉淀的粗品用乙醚洗三遍，干燥后用反相高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）純化，得到最終的產(chǎn)品Gluc-Lys（NOTA）-KE108。

1.3 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108制備

向西林瓶中依次加入0.1 mol·L-1醋酸緩沖液（100μL，pH=4.0），AlCl3的0.1 mol·L-1醋酸緩沖液（3μL，2 mmol·L-1），10μL 1 mg·mL-1的龍膽酸，100μL［18F］F-生理鹽水溶液，200μL無水乙腈，加入Gluc-Lys（NOTA）-KE108（50μL，1 mg·mL-1），95℃反應(yīng)10 min，冷卻至常溫。用1 mL去離子水稀釋，取其中20μL用HPLC測定標(biāo)記率。然后標(biāo)記物緩慢上Sep-pak C-18 light柱（預(yù)先活化，用10 mL無水乙醇、10 mL純化水活化后吹干），用5 mL純化水洗去未反應(yīng)的18F氟離子等水溶性雜質(zhì)，用1 mL的75%乙醇淋洗下產(chǎn)品，通過氮吹除去乙醇，并加入適量生理鹽水稀釋。

利用高效液相色譜儀對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記率、比活度、放射性化學(xué)純度的測定，液相條件如表2所示。

表2 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108高效液相色譜條件Table 2 HPLC conditions of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108

1.4 理化性質(zhì)研究

1.4.1 脂水分配系數(shù)

取500μL正辛醇、400μL磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Saline，PBS）溶液置于2 mL離心管內(nèi)，之后加入100μL Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108注射液。將混合液劇烈旋渦充分混合1 min，并以10 000 min-1的速度離心5 min。從上述溶液中提取100μL有機(jī)相，添加到含有400μL正辛醇和500μL PBS的新離心管中，重復(fù)上述步驟三次。分別取100μL有機(jī)相和水相（n=5）溶液，使用自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀測定，計(jì)算脂水分配系數(shù)（lgP值）。

1.4.2 體外穩(wěn)定性

在體外分別進(jìn)行標(biāo)記物在生理鹽水和10%小牛血清中的穩(wěn)定性測定。檢測在生理鹽水中的穩(wěn)定性：將37 MBq Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108溶于生理鹽水中，在室溫下放置2 h，通過HPLC測定標(biāo)記物在0.5 h、1 h和2 h的放射性化學(xué)純度。檢測在血清中的穩(wěn)定性：將37 MBq Gluc-Lys（［18F］NOTA）-KE108溶于1 mL小牛血清中，37℃孵育，分別在0.5 h、1 h和2 h取300μL上述血清，加入相同體積的乙腈渦旋、離心，取上清液通過0.22μm過濾器，用HPLC進(jìn)行檢測。

1.5 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)及荷瘤鼠構(gòu)建

所有細(xì)胞株均培養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，SSTR陽性腫瘤AR42J和BON1細(xì)胞株用DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將AR42J細(xì)胞種于BALB/c小鼠（20 g左右）右上肢腋下（腫瘤直徑為0.5~1.0 cm）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.2 細(xì)胞飽和實(shí)驗(yàn)

將生長狀態(tài)良好的AR42J和BON1細(xì)胞分別鋪于24孔板，細(xì)胞數(shù)量約為1×105，培養(yǎng)24 h。向每孔內(nèi)加入Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108（放射性濃度范圍1~250 nmol·L-1），抑制組加入Gluc-Lys（NOTA）-KE108（每孔10μL，100μg·mL-1）阻斷細(xì)胞攝取，在37℃孵育1 h。然后用1 mL PBS（pH=7.4）洗滌兩次細(xì)胞，最后使用1 mL NaOH（1 mol·L-1）消化5 min裂解細(xì)胞。采用自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀測量收集的放射性活度。采用GraphPad Prism 5.0軟件計(jì)算Bmax和Kd值。

1.5.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

向生長狀態(tài)良好的每孔AR42J和BON1細(xì)胞內(nèi)加 入37 kBq Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在37℃培養(yǎng)15 min、0.5 h、1 h、2 h后，抑制組加入Gluc-Lys（NOTA）-KE108（每孔10μL，100μg·mL-1）阻斷細(xì)胞攝取，之后用1 mL PBS（pH=7.4）洗滌兩次細(xì)胞，使用1 mL NaOH（1 mol·L-1）消化5 min裂解細(xì)胞，最后計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的攝取率。攝取率=細(xì)胞中的放射性計(jì)數(shù)/總放射性計(jì)數(shù)×100%。

1.6 PET顯像研究

取AR42J荷瘤鼠，正常組經(jīng)尾靜脈給藥（3.7 MBq（100μL·只）），分別在給藥后0.5 h、1 h、2 h和3 h進(jìn)行PET顯像，小鼠呈俯臥位，使用異氟烷和氧氣混合全身麻醉下掃描。抑制組在Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108給藥前0.5 h注射Gluc-Lys（NOTA）-KE108前體（100μg/125μL），使用異氟烷和氧氣混合全身麻醉下掃描小鼠。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行衰減校正。勾畫腫瘤感興趣區(qū)（Region of interest，ROI），記錄ROI內(nèi)的平均計(jì)數(shù)［（%ID·g-1，-x±s）］。使用Prism軟件計(jì)算各主要部位的Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108富集以及靶與非靶比值。

1.7 生物分布研究

取8只AR42J荷瘤鼠隨機(jī)分為兩組，每組4只。正 常 組 靜 脈 注 射0.18 MBq Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108后，觀察探針在AR42J荷瘤鼠體內(nèi)的分布情況。抑制組將Gluc-Lys（NOTA）-KE108（100μg）和Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108共注射（n=4），小鼠在注射后1 h處死并解剖，取心、肝、脾、肺、骨、腫瘤等組織和臟器，稱取重量，用自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀計(jì)算放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算各組織%ID·g-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 多肽合成

采用Fmoc固相合成法，通過氨基酸縮合，樹脂上多肽的切除，多肽的環(huán)化，反相HPLC分離純化，得到最終的產(chǎn)品Gluc-Lys（NOTA）-KE108。由質(zhì)譜圖（圖3）可知，ESI-MS（+）m/z：1 852.8，說明制備得到的多肽分子量與Gluc-Lys（NOTA）-KE108理論分子量（1 852.1）相符合。通過HPLC分析（圖4）可知，其純度大于95%，保留時(shí)間為9.09 min。

圖3 Gluc-Lys(NOTA)-KE108多肽質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of Gluc-Lys(NOTA)-KE108

2.2 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108制備

通過HPLC分析，Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108保留時(shí)間為9.69 min（圖4），與Gluc-Lys（NOTA）-KE108多肽的HPLC保留一致（9.09 min），由此確定標(biāo)記化合物制備完成。Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108標(biāo)記率為（30±5）%（n=6），放射化產(chǎn)率為（20±5）%（n=6），經(jīng)HPLC檢測放射性純度大于95%，比活度大于1.37 GBq·μmol-1。

圖4 Gluc-Lys(NOTA)-KE108與Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108的HPLC分析圖譜Fig.4 HPLC analysis of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 and non-radioactive compound Gluc-Lys(NOTA)-KE108

2.3 理化性質(zhì)研究

測得Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在正辛醇和PBS中的脂水分配系數(shù)lgP=-2.172±0.03（n=3），說明該探針呈水溶性，利于腎臟代謝。通過HPLC分析可知，Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在生理鹽水和小牛血清中都很穩(wěn)定（圖5），放置2 h放化純均大于95%。

圖5 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在生理鹽水(a)和血清中(b)的體外穩(wěn)定性分析圖譜Fig.5 In vitro stability of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in saline(a)and serum(b)

2.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

2.4.1 細(xì)胞飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)

Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在AR42J和BON1細(xì)胞中的飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。在AR42J細(xì)胞中Kd值為（152.3±49.1）nmol·L-1（n=4），Bmax為7.8×104min-1/105細(xì)胞。在BON1細(xì)胞中的Kd值 為（45.5±13.6）nmol·L-1（n=4），Bmax為1.9×104min-1/105細(xì)胞。Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108展現(xiàn)了較高的SSTR靶向能力。

圖6 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J(a)和BON1(b)細(xì)胞中飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)Fig.6 Saturation binding experimental results of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J(a)and BON1(b)cells

2.4.2 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在AR42J和BON1細(xì)胞中攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在AR42J細(xì)胞中攝取率隨時(shí)間延長不斷增加，在1.5 h達(dá)最大值為（5.31±0.37）%，明顯高于抑制組（2.84±0.09）%。在BON1細(xì)胞中攝取率在30 min達(dá)最大，為（4.83±0.53）%，同樣探針能夠被特異性抑制（（2.12±0.53）%）。

圖7 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J(a)和BON1(b)細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的攝取Fig.7 Uptake of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J(a)and BON1(b)cells at the indicated time points

2.5 PET顯像研究

Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在AR42J和BON1腫瘤細(xì)胞均具有良好的細(xì)胞親和力和特異性，我們選擇在AR42J腫瘤鼠中進(jìn)行PET顯像。結(jié)果顯示：Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在肝臟和腎臟攝取值高，說明可通過腎臟和肝膽進(jìn)行清除，AR42J腫瘤攝取在注射后0.5 h達(dá)到峰值（（2.25±0.44）%ID·g-1），之后稍微降低并逐漸趨于平穩(wěn)（圖8（a）），但由于周圍器官攝取值較高，對比度較低（圖8（b）），注射后1~2 h為顯像最佳時(shí)間。

圖8 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J荷瘤鼠中不同時(shí)間點(diǎn)的PET顯像(a)及定量分析(b)Fig.8 PET imaging(a)and quantitative analysis(b)of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J tumor-bearing mice at the indicated time points

采用Gluc-Lys（NOTA）-KE108進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)，評價(jià)Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在AR42J腫瘤中的結(jié)合特異性和選擇性（圖9）。將Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108與Gluc-Lys（NOTA）-KE108共注射后1 h進(jìn)行PET顯像。結(jié)果顯示：腫瘤部位的放射性攝取顯著降低，攝取值（1.65±0.33）%ID·g-1和（0.82±0.17）%ID·g-1。其腫瘤部位的攝取與肌肉攝取基本一致，顯示Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108的攝取機(jī)制是以SSTR介導(dǎo)。

圖9 有無添加抑制劑注射Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 1 h后AR42J荷瘤鼠體內(nèi)的PET顯像(a)及定量分析(b)Fig.9 PET imaging(a)and quantitative analysis(b)of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J tumor-bearing mice with or without adding inhibitor after 1-h injection

2.6 生物分布研究

Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在AR42J荷瘤鼠中生物分布數(shù)據(jù)如表3所示。由表3可知，在給藥后1 h，探針在腎臟的放射性攝取最高，同時(shí)肝臟對該探針的攝取也相對較高。當(dāng)然，Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108在骨中也有少量的攝取，說明探針在體內(nèi)未發(fā)生明顯的分解，在血液中的攝取較低，說明探針可以快速地分布在組織器官中，在SSTR表達(dá)較多的腎上腺中具有一定的攝取，表明其與SSTR具有親和力。在腫瘤中放射性攝取值為（2.04±0.40）%ID·g-1，并且加入Gluc-Lys（NOTA）-KE108以被明顯抑制，攝取值為（1.15±0.08）%ID·g-1，同樣的在腎上腺組織也表現(xiàn)出相同的放射性攝取抑制，表明探針具有SSTR靶向性和特異性。

表3 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J荷瘤鼠中注射后1 h生物分布（n=4）Table 3 Biodistribution results of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in SSTR-positive AR42J tumor-bearing mice for 1 h(n=4)

3 討論與結(jié)論

本研究采用Fmoc固相合成法，合成得到Gluc-Lys（NOTA）-KE108生長抑素類似物。Al18F復(fù)合物和Gluc-Lys（NOTA）-KE108通過螯合反應(yīng)制備了Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108，經(jīng)過Sep-pak C-18 light柱純化之后放化純大于95%，總合成時(shí)間為20 min。水溶性較好，在生理鹽水和小牛血清中放置2 h后，放化純大于95%，體現(xiàn)出良好的體外穩(wěn)定性。而采用協(xié)同配體進(jìn)行間接標(biāo)記的99Tcm-HYNICKE108［25］，兩步法標(biāo)記工藝復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間。多個(gè)協(xié)同配體的加入給產(chǎn)物的純化也帶來了一定的困難。Al18F標(biāo)記方法雖然標(biāo)記率較低，但是制備工藝簡單易于操作，并且穩(wěn)定可靠重復(fù)性高。而且Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108采用了糖基化修飾的KE108多肽作為標(biāo)記前體，可增加在腫瘤部位的攝取。與18F-Ta-Gluc-TOCA［19］相比，腫瘤的攝取相當(dāng)。通過細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該探針在PET顯像中展現(xiàn)了良好的SSTR靶向性和特異性，在AR42J和BON1細(xì)胞上的受體表現(xiàn)出較高的結(jié)合親和力和特異性。但是，在生物分布實(shí)驗(yàn)中，Gluc-Lys（［Al18F］NOTA）-KE108少量的骨攝取，表明探針在體內(nèi)具有輕微的不穩(wěn)定性，下一步將準(zhǔn)備添加穩(wěn)定劑進(jìn)行進(jìn)一步探索。