車凌儀，焦智慧，任淑敏，宋宇岑，高 旭，馬 騫

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科遺傳與產(chǎn)前診斷中心，鄭州 450072)

外顯子組測序(exome sequencing,ES)是利用序列捕獲技術(shù)將基因組的外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測序的一種分析方法。外顯子組的序列約占全基因組序列的1%，且大多數(shù)與疾病相關(guān)基因變異均位于外顯子區(qū)域。因此，外顯子組測序以其經(jīng)濟(jì)、有效的優(yōu)勢成為鑒定遺傳性疾病基因變異的常用方式[1-2]。ES在兒科及成年疑似遺傳病患者中應(yīng)用已相對成熟，診斷率可達(dá)25%～29%[3]。在兒童群體中，外顯子組測序主要用于診斷患有多種先天性異常、神經(jīng)發(fā)育障礙及癲癇發(fā)作的兒童。在成人群體中，外顯子組測序的常見適應(yīng)證為神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)肌肉疾病、腫瘤疾病和心血管疾病[4-5]。

臨床上ES被應(yīng)用于超聲異常的胎兒，目前產(chǎn)前ES的診斷率可達(dá)50%～80%。有研究指出，在核型和染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)給出正常的結(jié)果后，ES可將結(jié)構(gòu)異常胎兒的診斷率提高約8%～10%。在臨床診斷中，ES數(shù)據(jù)分析是由個體表型驅(qū)動的，當(dāng)胎兒表型提示高度異常時，一種特定目的性診斷，如單基因檢測或基于表型的基因組套檢測可能更適合作為首選方法，但當(dāng)常規(guī)測試無法確診時，可將ES作為另一種選擇[6-10]。鑒于ES在產(chǎn)前診斷中的使用率不斷提高，本文針對美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)發(fā)布的ES產(chǎn)前應(yīng)用的指南要點進(jìn)行解讀，以幫助臨床醫(yī)生、遺傳咨詢師和其他醫(yī)學(xué)專業(yè)人士了解ES的復(fù)雜性及含義，指導(dǎo)臨床實驗室制定與產(chǎn)前ES相關(guān)的方案和政策。

1 考慮要點

1.1 檢測前考慮要點 (1)適應(yīng)證：胎兒超聲異常，但染色體核型分析和CMA無異常的孕婦可考慮采用ES，當(dāng)胎兒超聲表現(xiàn)高度懷疑特定單基因病時，應(yīng)首選單基因或靶向基因測序，如嬰兒型多囊腎等單基因病[11]。此外，ES不適用于超聲提示染色體非整倍體風(fēng)險及既往不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者。(2)臨床醫(yī)生應(yīng)充分與遺傳學(xué)專家溝通，在了解檢測技術(shù)及其局限性的基礎(chǔ)上選擇檢測技術(shù)[12]。(3)檢測前應(yīng)收集完整的臨床信息，如影像學(xué)資料、既往病史、家族遺傳史及生育史等。(4)建議胎兒及其父母同時進(jìn)行ES檢測及位點驗證，以提高疾病診斷率，同時分析家系結(jié)構(gòu)，追蹤變異來源，為產(chǎn)前診斷提供最優(yōu)選擇[13]。(5)知情同意：應(yīng)告知孕婦及家屬所報告基因的變異類型，解釋陰性報告情況、明確檢測周期、檢測技術(shù)的優(yōu)缺點及潛在風(fēng)險，允許受檢者自主選擇是否報告意外發(fā)現(xiàn)[14]。(6)針對產(chǎn)前篩查，檢測周期應(yīng)盡可能縮短，以方便后續(xù)醫(yī)學(xué)決策及處理，檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)明確告知受檢者檢測周期[15]。(7)進(jìn)行宮內(nèi)標(biāo)本采集時，胎兒標(biāo)本應(yīng)排除母體細(xì)胞污染，并出具鑒定報告。

1.2 發(fā)布報告考慮要點 在提高ES診斷率的同時，可能識別出一些臨床上有價值但與原始測序目的不相關(guān)的數(shù)據(jù)。因此，檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)明確告知檢測報告的基因和基因變異的范圍。

1.2.1 已知致病基因 (1)報告與臨床表型相關(guān)的致病及疑似致病變異，需通過相關(guān)軟件和文獻(xiàn)進(jìn)行致病變異的確定。(2)對于臨床意義未明的變異(variant of unknown significance,VUS)，實驗室應(yīng)考慮適合胎兒臨床診斷的基因中報告VUS，尤其是針對常染色體隱性遺傳類疾病，需更注意預(yù)測為致病或疑似致病變異的雜合VUS變異。

1.2.2 意義未明基因 (1)在檢測中，可能會出現(xiàn)功能未知相關(guān)基因或意義不明確的候選基因，這些基因報道主要基于實驗內(nèi)部數(shù)據(jù)、動物模型建立或有限數(shù)量公開的病例報道。此外，與臨床表型不相關(guān)意義未明基因的變異致病性等級不應(yīng)高于VUS[16]。(2)檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)明確說明產(chǎn)前ES分析標(biāo)準(zhǔn)，檢測基因范圍僅限于已知致病基因及候選基因。檢測結(jié)果應(yīng)通過報告告知受試者。

1.2.3 胎兒檢測意外發(fā)現(xiàn) 檢測結(jié)果中的意外發(fā)現(xiàn)是指發(fā)現(xiàn)與初期檢測中不相關(guān)的基因變異位點，這些位點并不包含在ACMG推薦的意外發(fā)現(xiàn)列表中。這些意外發(fā)現(xiàn)通常是與胎兒表型無關(guān)，無法通過超聲檢測發(fā)育異常獲得提示，但這些意外發(fā)現(xiàn)的變異位點與胎兒的神經(jīng)發(fā)育、智力障礙或代謝異常相關(guān)基因密切相關(guān)。(1)在報告中，可報道導(dǎo)致兒童期早發(fā)性疾病的高頻基因變異，如與非綜合征性智力障礙、神經(jīng)發(fā)育疾病和代謝異常等疾病相關(guān)的基因變異。(2)一般不報道未知致病基因或與隱性遺傳病相關(guān)的基因變異，所有基因變異需參考ACMG變異分類。

1.2.4 父母檢測意外發(fā)現(xiàn) 檢測父母樣本是為了進(jìn)行攜帶者篩查鑒定，針對于許多隱性類遺傳疾病，如遲發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、神經(jīng)肌肉疾病、心血管疾病和遺傳性腫瘤綜合征等，這種篩查對于了解家系遺傳分布，指導(dǎo)產(chǎn)前篩查具有重要意義。(1)實驗室應(yīng)制定相應(yīng)規(guī)定，如果家系是常染色體隱性遺傳或X連鎖遺傳方式，需報告父母突變位點及攜帶方式。(2)檢測前應(yīng)針對意外發(fā)現(xiàn)進(jìn)行充分的知情告知和溝通，使受檢者了解此次檢測有可能發(fā)現(xiàn)與當(dāng)前疾病無關(guān)的致病突變，讓受檢者自行決定是否需要被告知。

1.2.5 ACMG推薦的意外發(fā)現(xiàn) (1)明確告知受檢者可能產(chǎn)生的意外發(fā)現(xiàn)或次要發(fā)現(xiàn)，并征求受檢者意愿，選擇是否報告及報告內(nèi)容。(2)應(yīng)參考ACMG發(fā)布的意外發(fā)現(xiàn)報告指南列出受檢者要求報告的意外發(fā)現(xiàn)[17]。

1.2.6 父母親緣關(guān)系錯誤 知情同意：應(yīng)告知受檢者檢測結(jié)果存在揭示非親生關(guān)系的可能。

1.2.7 血緣關(guān)系 (1)應(yīng)用生物信息學(xué)分析，在報告中需告知受檢者檢測結(jié)果可能發(fā)現(xiàn)父母間的近親關(guān)系。(2)當(dāng)提示父母樣本為未被公開的一級或二級親緣關(guān)系時，應(yīng)遵循ACMG發(fā)布的意外發(fā)現(xiàn)近親指南的建議。

1.3 檢測后的考慮要點 (1)不管測試結(jié)果如何，建議進(jìn)行測試后咨詢，應(yīng)由相關(guān)專業(yè)人員提供檢測后的咨詢及評估，最好是遺傳學(xué)專業(yè)人員。(2)在未得到基因診斷報告前，產(chǎn)前護(hù)理基于B超結(jié)果提示的信息獲得的基因診斷可用于指導(dǎo)孕婦的護(hù)理和治療。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，陰性的ES結(jié)果并不能排除遺傳疾病的可能，檢測結(jié)果不能作為胎兒預(yù)后正常的依據(jù)。(3)遺傳咨詢中，應(yīng)明確告知受檢者變異位點的致病性可能隨時間的推移發(fā)生改變。受檢者再次妊娠時應(yīng)進(jìn)行重分析，檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)對變異位點的致病性進(jìn)行定期的回顧性分析[18]。

1.4 有關(guān)費(fèi)用的考慮要點 (1)當(dāng)胎兒異常未能明確診斷為某個單基因疾病時，無需進(jìn)行單基因檢測和基因組套檢測，ES可替代進(jìn)行產(chǎn)前診斷。(2)產(chǎn)前診斷ES的費(fèi)用因檢測平臺和方法及受試者支付方式、保險類型的不同而存在差異。

1.5 關(guān)于重分析的考慮要點 (1)對尚未決定和陰性檢測結(jié)果，間隔12個月進(jìn)行重分析可顯著增強(qiáng)臨床診斷率[19]，尤其是對于兒童成長和發(fā)育有監(jiān)督和指導(dǎo)性建議。(2)對于發(fā)現(xiàn)基因功能未明確的家系，重分析可協(xié)助審核臨床診斷與胎兒表型的關(guān)系。(3)對尚未作出診斷或陰性檢測案例，可對出生后出現(xiàn)新癥狀的胎兒樣本進(jìn)行重分析。對于考慮再生育計劃的父母，建議對12個月以上的歷史樣本進(jìn)行重分析[20]。(4)如果原始外顯子組測序報告不能解釋胎兒發(fā)生異常表型的原因，可考慮對結(jié)果進(jìn)行重分析。(5)檢測平臺應(yīng)根據(jù)自身情況，制定關(guān)于重分析和發(fā)布修正報告的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，并嚴(yán)格執(zhí)行。

1.6 針對家系檢測的考慮要點 在胎兒中檢測出的致病或疑似致病變異可對其他高危家系成員進(jìn)行檢測，評估其生育風(fēng)險。

2 專業(yè)的醫(yī)療護(hù)理教育

研究表明，檢測前有專業(yè)的遺傳學(xué)專家介入可顯著提高基因診斷對受檢者的價值?；驒z測行業(yè)的規(guī)范要依靠合格的從業(yè)人員來完成。這需要檢測機(jī)構(gòu)、臨床醫(yī)師、遺傳學(xué)專家共同努力，借鑒國外經(jīng)驗，制定相應(yīng)的人才管理機(jī)制，培養(yǎng)相關(guān)專業(yè)人才，推動行業(yè)規(guī)范的優(yōu)化和改進(jìn)。

3 結(jié) 論

胎兒ES作為胎兒醫(yī)學(xué)中一種新的診斷方法，為超聲異常胎兒的判定提供了一種新的檢測途徑，尤其是在胎兒骨骼異常和胎兒頸部透明層增厚(nuchal translucency，NT)的應(yīng)用中較為常見。若超聲檢測提示骨骼發(fā)育異?；騈T增厚等癥狀，建議臨床醫(yī)生充分告知受試者檢測方法的優(yōu)勢和局限性，可建議先行CMA檢測，若結(jié)果為陰性，再進(jìn)一步進(jìn)行外顯子組測序。在胎兒結(jié)構(gòu)異常的亞群中，外顯子組測序能更好地確診與胎兒發(fā)育障礙相關(guān)的基因變異，并能準(zhǔn)確提供預(yù)后信息及未來妊娠的再發(fā)風(fēng)險。

產(chǎn)前診斷主要是為了判斷胎兒的健康從而達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。在超聲檢測分析提示異常時，外顯子組測序可幫助父母對此次懷孕做出自主并具前瞻性的預(yù)測，結(jié)合兒科、產(chǎn)科等科室進(jìn)行多學(xué)科會診評估胎兒治療的可能性及預(yù)后。Mone等[20]報道，約40%的畸形胎兒可被檢測出相應(yīng)的遺傳病因，而在剩余未能被診斷的胎兒中，超過8%能通過ES得到精確診斷，提供的信息更利于父母做決策，評估是否終止妊娠以及了解再育風(fēng)險。此外，發(fā)揮ES高診斷率優(yōu)勢的同時要盡量避免相應(yīng)的倫理問題，檢測平臺可以借鑒ACMG發(fā)布的指南，做好檢測前后的遺傳咨詢及知情同意，明確檢測范圍及局限性，將檢測報告價值發(fā)揮到最大，讓更多患者從中受益。