張燕妮，楊雨涵，辛 陽，李雙全，鞠會艷*

（吉林大學植物科學學院·吉林長春·130062）

在微生物相關研究工作中，菌種的保存是十分重要的。每株菌種性質不一樣，在利用土壤微生物進行相關研究時，能從土壤中分離出一些有意義的菌種，但接種到平板上的菌株在4℃低溫條件下也僅能保存數(shù)天，并且多次接種后菌株性質也會發(fā)生一些變化，故應當對菌株進行長期保存以便今后更有效地分析菌株的生理生化性質和實踐應用意義。本研究探索了幾種菌種的保存方法，并比較了這幾種方法的優(yōu)劣[1-3]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品

2020年從白城市通榆縣新華鎮(zhèn)永安屯A、B、C和D不同地點采取一定土壤樣品。這幾個地點位于東經123°1′、北緯44°47′、海拔153.0m、氣壓995.0hPa。這8個地點的土壤屬于pH 8.60的鹽堿土。

1.1.2 菌株來源

從采取的鹽堿土中分離純化得到9種菌株。其中4種真菌中Y8和C4-3通過了12%氯化鈉的鹽篩，Y10、Y11通過了16%氯化鈉的鹽篩；2種細菌D4-1、X10和3種放線菌X12、ⅠB、Ⅲ18均通過了12%氯化鈉的鹽篩。

1.1.3 主要培養(yǎng)基和儀器

LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基[2]、6mm正方形濾紙片、凍存管、10%甘油、30%甘油生理鹽水（15mL甘油+氯化鈉0.45g+蒸餾水至50mL）、1.5mL EP管、移液器、恒溫培養(yǎng)箱、4℃冰箱、-20℃冷凍柜、-80℃冷凍冰箱。

1.2 保存方法

1.2.1 PDA生長菌株保存[4,5]

A：濾紙片保存法（-20℃保存）：將所收集的菌種分別接種培養(yǎng)基，用無菌小鑷子夾住滅菌濾紙片（9片濾紙片）放入平板中接種的菌周圍（詳見圖1），等待菌絲長至濾紙片上后，可用無菌小鑷子將其小心放入凍存管中。每個凍存管放3片，為3個重復，旋緊蓋子后做好標注放入-20℃冰箱冷凍保存。

圖1 放入濾紙片之后等待長滿菌絲的5個平板Fig.1.Five plates waiting to be covered with hyphae after inserting the filter paper

B：冷凍管保存法（-80℃保存）：將所收集的菌種分別接種培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)3~5天后,向1.5 mL EP管中加入1.2mL滅菌過的10%甘油，用接種環(huán)從菌株生長良好的PDA平板上刮取適量菌絲轉移到EP管中，每個菌種保存3份，做好標注后置于-80℃低溫冰箱中保存。

1.2.2 LB生長菌株保存[6]

A：斜面保藏法(4℃保存)：將滅好菌的LB固體培養(yǎng)基趁熱吸取800μL裝進1.5mL EP管等待凝固，將分離得到的菌株接種到LB斜面上，在25℃培養(yǎng)3~5天，直到菌株長滿斜面，然后向試管中加入經滅菌的10%甘油350μL，做3個重復，置于4℃冰箱保存。

B：菌液保存法（-20℃保存）：將所收集的菌種分別接種培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)3~5天后。吸取2mL高壓滅菌的30%甘油生理鹽水（15mL甘油+氯化鈉0.45g+蒸餾水至50mL）洗下平板里的菌苔,吸取1.2 mL菌液加入高壓滅菌的潔凈1.5mL EP管中,最后放入-20℃冷凍柜中保存。

2021年1 月初至3月中旬，保存時間兩個多月。

1.3 活化

1.3.1 濾紙片保存菌種的活化-20℃保存的真菌用鑷子取出濾紙片置于PDA培養(yǎng)基上，倒置放入21℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 冷凍管保存菌種的活化

-80℃保存的真菌放置16h再進行活化。另外一種方法是將-80℃保存的真菌直接吸取200μL再進行涂板（PDA培養(yǎng)基），倒置放入21℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 斜面保存菌種的活化

4℃細菌、放線菌用接種環(huán)挑出小塊放進LB培養(yǎng)基上，正置放入21℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 菌液保存菌種的活化

-20℃細菌、放線菌直接吸取200μL再進行涂板（LB培養(yǎng)基），倒置放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 結果與分析

2.1 不同保存方法菌株的活化分析

2.1.1 PDA上生長的菌株

由圖2可見菌株活化后的生長情況，菌株活化涂板后生長基本遍布整個培養(yǎng)皿。濾紙片保存的菌株生長良好，應用濾紙片保存的真菌全部生長，活化結果較好。但是應用冷凍管保存的真菌中C4-3完全沒生長（圖2下排左邊第2個培養(yǎng)皿）。圖3可見濾紙片保存的C4-3菌株活化后在培養(yǎng)基上生長了（最右邊的培養(yǎng)皿），但冷凍管保存的C4-3菌株活化后沒有生長。

圖2 濾紙片保存（上5個）和冷凍管保存（下5個）Fig.2 Filter paper sheets(upper 5)and cryotube storage(lower 5)

圖3 C4-3的兩種保存Fig.3 Two kinds of preservation of C4-3

2.1.2 LB上生長的菌株

由圖4可見斜面保存法和菌液保存法的菌種活化后的生長情況，涂板后的菌基本長滿整個培養(yǎng)皿，接種的菌株生長良好，活化結果很好。兩種存菌方法都比較成功。

圖4 細菌放線菌的斜面保存法（中間4個）和菌液保存法（左右各兩個）

3 小結

對于菌株保存方法的探索發(fā)現(xiàn)采用的四種不同保存方法均簡單易操作，對于真菌的保存建議應用濾紙片保存法，以獲得更加穩(wěn)定的保存，而細菌、放線菌的保存則用斜面保存法和菌液保存法皆可。

至此，對于耐鹽細菌的存菌工作，我們仍需進一步的探索，以獲得更加穩(wěn)定有效的保存菌種方法，來保證菌株的穩(wěn)定性及活性。