李 妍 彭心怡 孔燕妮 郭 勇

近年來，實體腫瘤治療領(lǐng)域有57 種免疫檢查點抑制劑進(jìn)入了17 種腫瘤治療的審批流程，其中有7種分別針對程序性死亡受體1（Programmed Death 1/Ligand 1，PD1/PDL1）的單克隆抗體藥物被美國FDA批準(zhǔn)[1-2]。臨床研究注冊數(shù)據(jù)（Clinicaltrials.gov）顯示，在過去2 年里，進(jìn)入臨床試驗的免疫檢查點治療項目數(shù)逐年增加，但速率正在減緩[3]，年齡、既往接受化療的線數(shù)、體力、腫瘤分期、病理分級均可能影響免疫治療療效[4-5]。目前臨床試驗的亞組數(shù)據(jù)或免疫治療相關(guān)數(shù)據(jù)不夠充分，尚缺乏真實世界樣本進(jìn)一步證實臨床病理特征聯(lián)合臨床參數(shù)在常見實體腫瘤免疫檢查點抑制劑療效預(yù)測中的作用。本研究將基于單中心真實世界臨床患者應(yīng)用免疫檢查點抑制劑過程中的臨床參數(shù)、免疫代謝相關(guān)指標(biāo)以及中醫(yī)證型的參數(shù)做進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建COX 比例風(fēng)險回歸模型及列線（Nomogram）圖，預(yù)測免疫檢查點抑制劑療效構(gòu)建結(jié)合中醫(yī)證型參數(shù)的個體化模型。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2019 年2 月—2021 年2 月于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科接受免疫檢查點抑制劑治療的常見實體惡性腫瘤患者53 例。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理診斷明確為惡性腫瘤，中醫(yī)辨證分型參照《GB/T 16751.2-1997 中醫(yī)臨床診療術(shù)語證候部分國家標(biāo)準(zhǔn)（GB）[6]》《中醫(yī)診斷學(xué)》[7]；（2）美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC 第7 版分期制定的TNM分期[8]）為Ⅳ期的患者；（3）在入組時間內(nèi)初次接受免疫檢查點抑制劑單用或聯(lián)合治療；（4）有完整的代謝、免疫、中醫(yī)證型隨訪數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）隨訪數(shù)據(jù)不完整；（2）30 天內(nèi)接受免疫檢查點抑制劑治療；（3）有其他重要臟器器質(zhì)性病變，如心、肺、腎損害。

1.3 方 法 提取每例患者的年齡、性別、T 分期、N分期和M 分期[8]、客觀緩解時間、既往接受治療情況、聯(lián)合治療情況、免疫檢查點抑制劑用藥、瘤種、中醫(yī)證型、外周血免疫相關(guān)指標(biāo)（調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞Treg、CD3+CD4+、CD3+CD8+、自然殺傷細(xì)胞NK cells）、前白蛋白（prealbumin，PAB）、淀粉樣蛋白a（serum amyloid A protein，SAA）、乳酸脫氫酶、鐵蛋白、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率（neutrophil/lymphocyte ratio，NLR）、血小板與淋巴細(xì)胞比率（platelet/lymphocyte ratio，PLR）等臨床及實驗室指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)因素分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件及R 語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Kaplan-Meier 曲線分析計算風(fēng)險評分對腫瘤患者免疫檢查點抑制劑應(yīng)用客觀化解時間獲益的單變量因素，并使用Log-rank 檢驗對Kaplan-Meier 曲線進(jìn)行評估，檢驗水準(zhǔn)α=0.05（雙尾）。使用COX 風(fēng)險比例模型分析多變量因素，并協(xié)助構(gòu)建Nomogram 圖[9]。使用R 語言3.2.4 構(gòu)建Nomogram 圖并計算C 指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 在初次免疫檢查點抑制劑應(yīng)用期間出現(xiàn)進(jìn)展的21 例患者中：男16 例（76%），女5 例（24%）；年齡：≤50 歲1 例（4.8%），50～70 歲10 例（47.6%），≥70 歲10 例（47.6%）；疾病緩解時間：≤90天8 例（38.1%），90～200 天10 例（47.6%），≥200 天3 例（14.4%）；聯(lián)合治療情況：單用免疫治療2 例（9.6%），聯(lián)合化療12 例（57.1%），聯(lián)合靶向治療7 例（33.3%），聯(lián)合化療及靶向治療0 例；治療線數(shù)：一線應(yīng)用免疫藥物6 例（28.6%），二線應(yīng)用6 例（28.6%），三線應(yīng)用1 例（4.8%），三線及以上應(yīng)用8 例（38.1%）；治療期間中醫(yī)證型主要為陰虛證6 例（28.6%），脾虛證13 例（61.9%），血瘀證2 例（9.5%）；瘤種分布情況：肺癌8 例（38.1%），腸癌3 例（14.3%），胰腺癌3 例（14.3%），消化系統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌癌1 例（4.8%），肝癌1 例（4.8%），胃癌5 例（23.8%）。

在初次免疫檢查點抑制劑應(yīng)用期間未出現(xiàn)進(jìn)展的32 例患者中：男20 例（62.5%），女12 例（37.5%）；年齡：＜50 歲4 例（12.5%），50～70 歲21 例（65.6%），≥70 歲7 例（21.9%）；疾病緩解時間：＜90 天15 例（46.9%），90～200 天9 例（28.1%），≥200 天8 例（25.0%）；聯(lián)合治療情況：單用免疫治療6 例（18.8%），聯(lián)合化療9 例（28.1%），聯(lián)合靶向治療13例（40.6%），聯(lián)合化療及靶向治療4 例（12.5%）；治療線數(shù)：一線應(yīng)用免疫藥物9 例（28.1%），二線應(yīng)用3例（9.4%），三線應(yīng)用9 例（28.1%），三線以上應(yīng)用11例（34.4%）；治療期間中醫(yī)證型主要為陰虛證11 例（34.4%），脾虛證19 例（59.4%），血瘀證2 例（6.2%）；瘤種分布情況：肺癌11 例（34.3%），腸癌5 例（15.6%），胰腺癌4 例（12.5%），消化系統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌癌2 例（6.3%），肝癌1 例（3.1%），胃癌6 例（18.8%），其他瘤種3 例（9.4%）。

2.2 免疫檢查點抑制劑應(yīng)用過程中臨床參數(shù)的單因素分析 53 例腫瘤患者中，對所有14 項臨床參數(shù)進(jìn)行單因素COX 回歸分析，發(fā)現(xiàn)PAB（P=0.003），SAA（P=0.046）與惡性腫瘤患者免疫檢查點抑制劑客觀緩解時間相關(guān)。見表1。

表1 53 例腫瘤患者免疫檢查點抑制劑應(yīng)用臨床參數(shù)的單因素分析

2.3 多因素分析以評估免疫檢查點抑制劑應(yīng)用中客觀緩解出現(xiàn)進(jìn)展的獨立危險因素 根據(jù)單因素COX回歸分析結(jié)果，取P 值＜0.1 的PAB、SAA 進(jìn)一步行多因素回歸構(gòu)建生存風(fēng)險模型（R 語言rms 程序包），并得到生存風(fēng)險回歸模型（風(fēng)險評分RISK-Score=PAB×0.01498-SAA×0.00318），計算所有患者客觀緩解時間獲益風(fēng)險評分見表2。

表2 多因素分析評估客觀緩解出現(xiàn)進(jìn)展的獨立危險因素

表2 多因素分析評估客觀緩解出現(xiàn)進(jìn)展的獨立危險因素（續(xù)）

2.4 基于COX 多因素回歸分析的Kaplan-Meier 生存分析 使用R 語言survival 及survminer 程序包對COX 多因素回歸分析得到的RISK 風(fēng)險分值進(jìn)行Kaplan-Meier 生存預(yù)測，根據(jù)風(fēng)險評分預(yù)測公式計算每個患者的風(fēng)險評分，然后以中位數(shù)為cut-off 值，將所有患者分為高低危組（見圖1），在53 例惡性腫瘤應(yīng)用免疫檢查點抑制劑患者中，高危組患者預(yù)后顯著差于低危組，log-rank.P=0.001153。

圖1 對風(fēng)險評分RISKSCORE 進(jìn)行高低危分組后的Kaplan-Meier 生存曲線

2.5 Nomogram 圖的構(gòu)建 基于COX 分析得到的與免疫檢查點抑制劑用藥客觀緩解時間有獲益相關(guān)的P＜0.05 的獨立風(fēng)險因素：年齡、T 分期、N 分期、治療線數(shù)、聯(lián)合治療情況、中醫(yī)證型、風(fēng)險評分納入進(jìn)一步的模型構(gòu)建，構(gòu)建Nomogram 圖，由于本研究入組的均為Ⅳ患者，故僅將年齡、聯(lián)合治療情況、中醫(yī)證型、風(fēng)險評分等因素列入COX 回歸分析并構(gòu)建Nomogram 圖從而預(yù)測免疫檢查點抑制劑客觀緩解時間（見圖2），采用Bootstrap 法對Nomogram 圖進(jìn)行內(nèi)部驗證，自抽樣次數(shù)B=1000，驗證結(jié)果顯示，C 指數(shù)為0.7309（95%CI 為0.6391～0.8228），有良好的預(yù)測價值。

圖2 結(jié)合中醫(yī)證型的Nomogram 模型對腫瘤患者免疫檢查點抑制劑客觀緩解時間6 個月～1 年的預(yù)測

3 討論

由于腫瘤內(nèi)在機(jī)制的異質(zhì)性及患者宿主個體差異，很多患者對免疫檢查點治療的響應(yīng)性并不如預(yù)期高，腫瘤本身、腫瘤微環(huán)境以及宿主因素的復(fù)雜性均可能影響免疫治療應(yīng)答[10-13]。臨床研究設(shè)計可能也只能納入有限且檢測標(biāo)準(zhǔn)不一致的分子標(biāo)志物，如腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）、PD1/PDL1 表達(dá)、錯配修復(fù)缺陷（different mismatch repair，dMMR）狀態(tài)等[14]。因而，采用明確的分子標(biāo)志物聯(lián)合臨床參數(shù)協(xié)助預(yù)測免疫檢查點抑制劑的療效將有一定臨床意義。國內(nèi)腫瘤治療的中醫(yī)藥參與度極高，有研究證實中醫(yī)藥對腫瘤的獲益體現(xiàn)在不同方面，如保護(hù)放化療后正常組織和細(xì)胞損傷、增強(qiáng)化放療效力、減輕瘤周組織炎癥狀態(tài)、提高患者體力狀態(tài)、改善患者生活質(zhì)量及延長晚期患者生存時間[15]。結(jié)合中醫(yī)證候及代謝營養(yǎng)免疫狀態(tài)等臨床參數(shù)所建立的預(yù)測模型，有望成為潛在的免疫檢查點抑制劑療效預(yù)測的個體化工具。

臨床通常根據(jù)患者現(xiàn)有的分子表達(dá)如PD1/PDL1、TMB、dMMR 狀態(tài)來判斷免疫檢查點抑制劑的可能獲益，而在宿主因素及腫瘤微環(huán)境因素上常常依據(jù)疾病分期及常規(guī)實驗室檢查作出經(jīng)驗性判斷，尚未見可靠的評分系統(tǒng)來預(yù)測療效。本研究針對真實世界中正在接受免疫檢查點抑制治療的常見惡性實體腫瘤患者，所有的臨床數(shù)據(jù)都是前瞻性收集并儲存于本中心臨床資料數(shù)據(jù)庫，包括結(jié)合中醫(yī)證型的臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)，常規(guī)檢查中易獲取的隨訪期間外周血代謝、營養(yǎng)及免疫參數(shù)以及客觀緩解時間的結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)，通過R 語言進(jìn)行COX 生存單因素及多因素分析可能影響免疫檢查點抑制劑客觀緩解時間的臨床參數(shù)特征，進(jìn)一步構(gòu)建有中醫(yī)特征及臨床可及參數(shù)的個體化Nomogram 預(yù)測模型。我們對14 項臨床參數(shù)進(jìn)行單因素COX 回歸分析發(fā)現(xiàn)PAB（P=0.003）與SAA（P=0.046）與客觀緩解時間獲益有關(guān)；進(jìn)一步行多因素COX 回歸分析結(jié)果表明，年齡（P＜0.01），T 分期（P＜0.01），N 分期（P＜0.01），治療線數(shù)（P＜0.01），聯(lián)合治療情況（P＜0.01），中醫(yī)證型（P＜0.01），不同免疫檢查點抑制劑（P＜0.01）及瘤種（P＜0.01）是患者獲得客觀緩解時間獲益的獨立預(yù)后影響因素。采用相關(guān)因素構(gòu)建Nomogram 圖提示脾虛證的風(fēng)險評分較陰虛證低，血瘀證的風(fēng)險評分最高，聯(lián)合治療的風(fēng)險評分也低于單藥，內(nèi)部驗證的C 指數(shù)為0.7309（95%CI 為0.6391～0.8228），表現(xiàn)出良好的預(yù)測價值。

既往研究顯示，對免疫檢查點抑制劑治療有反應(yīng)患者的基線中位單核細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞計數(shù)均低于無反應(yīng)患者（P＜0.05），提示外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計數(shù)對晚期非小細(xì)胞肺癌患者免疫治療反應(yīng)具有一定預(yù)測價值[16]。相較于以往的研究，未研究通過外周血的髓系細(xì)胞數(shù)、代謝狀態(tài)、免疫細(xì)胞數(shù)、營養(yǎng)狀態(tài)來評估免疫檢查點抑制劑的預(yù)測價值，且結(jié)合中醫(yī)證型的特征納入Nomogram 建模有一定創(chuàng)新。由于本次研究的病例數(shù)來自單中心，數(shù)量較少，因而僅僅探索性運(yùn)用回歸模型及Nomogram 圖進(jìn)行數(shù)據(jù)療效預(yù)測，在今后的工作中可以繼續(xù)積累數(shù)據(jù)，完善模型評估及內(nèi)外部驗證，為免疫檢查點抑制劑的應(yīng)用提供可靠的預(yù)測工作。