快速樣品處理技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法測定水果和蔬菜中除蟲脲

趙雪寧，雷浩，高勤葉，賀習(xí)文

（陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測股份有限公司，陜西渭南 714000）

除蟲脲是一種特異性低毒殺蟲劑，屬于苯甲酸基苯基脲類，主要作用是抑制昆蟲表皮的幾丁質(zhì)合成，同時對脂肪體、咽側(cè)體等內(nèi)分泌和腺體有損傷作用，從而阻礙昆蟲蛻皮變態(tài)［1–4］。

除蟲脲廣泛應(yīng)用于蘋果、梨、柑橘等果樹，也用于茄果類、瓜類等蔬菜。除蟲脲的代謝產(chǎn)物氯苯胺和對氯苯基脲已被證明具有一定的毒性，同時除蟲脲具有致突變作用［5–8］，長期服食殘留有除蟲脲的果蔬，會直接影響人的身體健康。

目前檢測果蔬中除蟲脲的手段主要為液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法。武源［9］等基于QuEChERS液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中除蟲脲并進行了測量不確定度的評定；吳遲［10］等采用高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定甘藍中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和除蟲脲的含量；也有測定韭菜及茶葉中除蟲脲殘留量的相關(guān)報道［11–13］。液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法優(yōu)點是檢出限低、定性準(zhǔn)確，缺點是檢測成本高，難以滿足對除蟲脲進行定性、定量檢測的日常需要。除此之外，使用高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法檢測部分水果蔬菜中除蟲脲殘留量也有報道［14–21］。

筆者采用高效液相色譜法對多種水果和蔬菜中的除蟲脲含量進行測定，同時使用N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（Carbon-GCB）、C18填料等凈化材料對樣品提取液中的雜質(zhì)進行凈化，在不同基質(zhì)的果蔬樣品中均得到較高的加標(biāo)回收率，凈化效果理想，方法精密度高，操作簡便，檢測成本低，適合日常對果蔬中除蟲脲殘留量的篩查和檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國賽默飛世爾科技公司。

電子天平：（1）MS205DU型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多集團；（2）CP224C型，感量為0.1 mg，奧豪斯儀器（常州）有限公司。

離心機：H1850型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

渦輪混合器：XW–80A型，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份有限公司。

超聲波提取儀：KQ–100DB型，超聲功率為40 kHz，容量為4 L，昆山市超聲儀器有限公司。

除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為98.8%，阿爾塔科技有限公司。

乙腈：HPLC級，美國Sigma公司。

N-丙基乙二胺（PSA）：規(guī)格為10 g，粒徑為40～63 μm，德國CNW Technologies GmbH公司。

石墨化炭黑（Carbon-GCB）：規(guī)格為10 g，粒徑為38～120 μm，德國CNW Technologies GmbH公司。

鍵合硅膠C18填料：規(guī)格為10 g，粒徑為40～60 μm，德國CNW Technologies GmbH公司。無水硫酸鎂：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。蘋果、梨、柑橘、土豆、南瓜、白菜等果蔬樣品：市售。

實驗用水為一級水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)貯備液：1 000 μg／mL，準(zhǔn)確稱取除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 00 g，置于10.0 mL棕色容量瓶中，用乙腈超聲溶解，并定容至標(biāo)線。

除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度分別為100、10 μg／mL，以乙腈稀釋除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)貯備液制得。

1.2.2 樣品處理

將樣品用破壁機進行粉碎，制成混合均勻的試樣，稱取試樣2.5 g于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入10.0 mL乙腈，渦輪混合3 min，超聲提取10 min，靜置浸泡20 min，以8 000 r／min轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清液5 mL于10 mL離心管中，加入200 mg PSA、50 mg Carbon-GCB、0.5 g無水硫酸鎂、200 mg C18填料，渦輪混合30 s，靜置后取上清液，過0.45 μm濾膜后上機測定。

1.2.3 色譜條件

色 譜 柱：Kromasil 100–5–C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典阿克蘇諾貝爾公司）；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：257 nm；流動相：乙腈–水（體積比為55∶45）；柱溫：35 ℃；進樣體積：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長

將質(zhì)量濃度為10 μg／mL的除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)溶液在配備二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀上進行紫外全波長掃描，掃描后得到的紫外吸收光譜圖如圖1所示。除蟲脲在193 nm和257 nm處有吸收峰，試驗發(fā)現(xiàn)193 nm雖然響應(yīng)值較高，但雜峰比257 nm處更多，影響目標(biāo)峰的積分和計算，故選擇檢測波長為257 nm。

圖1 除蟲脲紫外吸收光譜圖

2.1.2 色譜柱

選擇最為常見的反相填料C18色譜柱，通過調(diào)節(jié)流動相配比等參數(shù)來達到最佳的分離效果和保留效果。分別采用美國賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)的Hypersil GOLD C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和瑞典阿克蘇諾貝爾公司生產(chǎn)的Kromasil 100–5–C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行比較試驗，結(jié)果表明Kromasil 100–5–C18柱具有更好的保留效果和色譜峰形，因此選用Kromasil 100–5–C18色譜柱。

2.1.3 流動相組成及配比

非極性固定相的色譜柱，常用的流動相有機組分有甲醇和乙腈，因為甲醇在低波長有較大吸收，可能造成溶劑干擾，因此有機相選用乙腈。

分 別 使 用 體 積 比 為50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30的乙腈–水作為流動相進行試驗，結(jié)果表明，隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)增加，目標(biāo)物保留時間持續(xù)縮短，色譜峰更加尖銳。綜合考慮實驗效果和成本，最終確定乙腈–水的體積比為55∶45。

2.1.4 柱溫

分別選擇柱溫為25、30、35、40、45 ℃進行試驗，結(jié)果表明柱溫為35℃時分離效果最佳，故選擇柱溫為35 ℃。

2.2 樣品處理

2.2.1 稱樣質(zhì)量

測試了不同稱樣質(zhì)量對測定結(jié)果的影響，以蘋果樣品為例，依次稱取蘋果試樣1、2.5、5、10 g，向每份樣品中加入相同含量的除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.2方法處理并測定。結(jié)果表明，當(dāng)稱樣質(zhì)量為5、10 g時，渦旋時無法充分混勻，超聲提取效果不佳，回收率相對較低；當(dāng)稱樣量為1、2.5 g時，提取效果較好，回收率均在90%以上。最終選擇稱樣質(zhì)量為2.5 g。

2.2.2 提取溶劑

利用加標(biāo)樣品，分別試驗了甲醇、乙腈、二氯甲烷及二氯甲烷–石油醚（體積比為3∶4）4種不同溶劑的提取效果，結(jié)果表明甲醇提取效果最差（回收率為50%～70%）；二氯甲烷的提取效果優(yōu)于甲醇，但低于乙腈、二氯甲烷–石油醚混合溶液；而石油醚揮發(fā)性強，毒性和刺激性氣味較大；乙腈對除蟲脲具有良好的溶解性，能夠滿足對除蟲脲的提取要求。綜合考慮，確定使用乙腈作為提取液。

2.2.3 提取時間

利用加標(biāo)樣品，分別選擇不同的超聲提取時間和浸泡時間進行試驗，結(jié)果表明當(dāng)超聲提取時間低于5 min時，提取效果較差；當(dāng)超聲提取時間為5～10 min時，樣品中添加的除蟲脲基本能夠完全提取。為了實現(xiàn)更好的提取效果，選擇將樣品超聲提取10 min，同時靜置浸泡20 min。

2.2.4 凈化材料

考慮到樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，依次采用PSA填料、C18填料、硅酸鎂填料、中性氧化鋁填料及PSA–C18、PSA–硅酸鎂、PSA–中性氧化鋁組合材料進行試驗，考察對樣品基質(zhì)的吸附效果，試驗結(jié)果表明PSA–C18填料凈化效果最佳，能夠消除大部分基質(zhì)樣品中的雜質(zhì)峰干擾，同時加入Carbon-GCB去除色素，加入無水硫酸鎂除去水分，能夠得到較好的色譜峰形和回收率。

2.3 線性關(guān)系

取除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，以乙腈稀釋，分別配制 成 質(zhì) 量 濃 度 為0.01、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2.3中色譜條件上機測定，以溶液的質(zhì)量濃度為自變量、對應(yīng)的色譜峰面積為因變量進行線性回歸，得線性方程：Y=55 343X–1 200，相關(guān)系數(shù)（r）為1.00，表明除蟲脲的質(zhì)量濃度在0.01～50 μg／mL范圍內(nèi)線性良好。

2.4 檢出限和定量限

分別將3倍、10倍信噪比對應(yīng)的除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算成樣品中除蟲脲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，作為方法檢出限、定量限，所得不同基質(zhì)樣品中除蟲脲的檢出限和定量限列于表1。

表1 不同果蔬樣品中除蟲脲的檢出限和定量限

由表1可知，土豆、南瓜、蘋果等果蔬中除蟲脲的檢出限為0.05 mg／kg，定量限為0.15 mg／kg；蒜苗、韭菜、柑橘等含有揮發(fā)性成分的果蔬，檢出限為0.06 mg／kg，定量限為0.20 mg／kg。

2.5 方法精密度

選取部分空白基質(zhì)樣品進行加標(biāo)試驗，每組進行6次平行試驗，以色譜保留時間計算定性重復(fù)性，以色譜峰面積計算定量重復(fù)性，所得結(jié)果列于表2。從表2可知，7種不同基質(zhì)的空白樣品中，除蟲脲的定性重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.2%，定量重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于3.0%，表明方法精密度良好，滿足定性和定量要求。

表2 方法精密度試驗結(jié)果

2.6 加標(biāo)回收率

選取具有代表性的11種不同基質(zhì)的樣品，分別進行加標(biāo)回收試驗，測定值及計算結(jié)果列于表3。

表3 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

由表3可知，加標(biāo)量分別為1倍檢出限、1倍定量限、3倍定量限時，11種不同果蔬樣品中除蟲脲的加標(biāo)回收率均大于85%，不同加標(biāo)濃度回收率為87.8%～110.0%，滿足檢測要求。

油麥菜加標(biāo)樣品色譜圖如圖2所示。由圖2可知，使用優(yōu)化后的儀器條件和加入凈化材料吸附雜質(zhì)后，目標(biāo)峰與樣品基質(zhì)分離效果良好，目標(biāo)峰峰形對稱，可以實現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

圖2 加標(biāo)油麥菜樣品色譜圖

2.7 方法比對

選取一份已知除蟲脲含量的質(zhì)控樣品，使用GB／T 5009.147—2003法對該樣品進行多次測試，測定平均值為2.36 mg／kg，使用本方法檢測結(jié)果為2.32 mg／kg，測量偏差為0.04 mg／kg，在標(biāo)準(zhǔn)允許范圍內(nèi)，證明本方法與標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果基本吻合。

3 結(jié)語

將水果和蔬菜樣品凈化后采用高效液相色譜法對樣品中除蟲脲含量進行測定，方法精密度和準(zhǔn)確度滿足技術(shù)要求，該方法操作簡便，檢測速度快，檢驗成本低，可用作水果和蔬菜中除蟲脲殘留量檢測的常規(guī)分析方法。