頂空固相萃取/表面增強拉曼法對揮發(fā)性農(nóng)藥的快速檢測研究

王翠萍，王 山，張 歡，王純榮

（江西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，江西 南昌330045）

我國是農(nóng)業(yè)大國，為減少病蟲害造成的損失，大部分農(nóng)作物在生長過程中都不同程度地使用了農(nóng)藥，從而導致了日趨嚴重的農(nóng)藥殘留問題。如2018年廣州和慈溪發(fā)生的蔬菜農(nóng)藥殘留事件，其中葉菜類農(nóng)藥殘留超標率達25%以上［1］。目前，對具有一定揮發(fā)性的農(nóng)藥的快速檢測已成為研究熱點。如地蟲磷作為大田作業(yè)常用的劇毒有機磷殺蟲劑［2］，可通過皮膚、呼吸道或消化道3種方式進入人體，嚴重危害人類健康［3］。福美鐵（二甲基二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥）常用于果園殺菌。加拿大衛(wèi)生部有害生物管理局（PMRA）依據(jù)毒理學建立的數(shù)據(jù)庫表明：長期使用福美鐵可能對人體產(chǎn)生較大危害［4］。因此，對地蟲磷和福美鐵的快速檢測研究具有重要意義。

目前，揮發(fā)性農(nóng)藥的主要檢測方法有氣相色譜（GC）［5］、氣相色譜－質譜法［6］、高效液相色譜－質譜聯(lián)用技術（HPLC-MS）［7－8］等。GB 23200.113－2018［9］中地蟲磷的檢出限為0.1 mg/kg。張晶等［10］通過氣相色譜得到福美鐵的檢出限為0.1 mg/kg。這些傳統(tǒng)方法雖然分辨率較高，但操作復雜、費用高昂且耗時長。因此亟待建立一種對此類農(nóng)藥的快速、靈敏和簡便的測定方法。

表面增強拉曼光譜（SERS）技術是基于拉曼光譜和納米技術的高靈敏分析技術，能夠反映有機分子的結構指紋信息，已發(fā)展成為靈敏的食品安全分析方法［11－15］。目前，已有采用SERS檢測有機化合物的研究報道［16－18］，但未見通過金納米膜頂空固相萃取揮發(fā)性農(nóng)藥并進行SERS檢測的研究。

本文以金納米薄膜作為SERS基底，通過頂空固相萃取農(nóng)藥并進行拉曼光譜檢測；探討了頂空固相萃取溫度、時間、NaCl含量和pH值等對SERS光譜的影響，并對定量檢測結果進行線性擬合分析，為頂空固相萃取/表面增強拉曼光譜法快速高效檢測揮發(fā)性農(nóng)藥提供了一種新的方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

不銹鋼片（304，無錫萬信金屬制品有限公司）；氯金酸、濃鹽酸、甲醇、丙酮、地蟲磷和福美鐵購于國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純；美汁源果粒橙購于江西農(nóng)業(yè)大學超市；自來水取自當?shù)亍?/p>

1.2 儀器

DXR2型激光顯微共焦拉曼光譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；SU8010型場發(fā)射掃描電鏡（日本日立公司）；GC9790Ⅱ型氣相色譜儀（福立分析儀器有限公司）。

1.3 金納米膜的制備

取0.5 cm×0.3 cm不銹鋼片，分別用蒸餾水和丙酮超聲5 min，取出干燥，并置于60℃水浴中用濃鹽酸浸泡15 min；取出后再分別用蒸餾水和甲醇超聲5 min，取出干燥，立即放入0.075%的氯金酸溶液中浸泡3 h（反應方程式：Fe+［AuCl4］－=Fe3++Au+4Cl－），取出自然干燥。樣品形貌特征使用場發(fā)射掃描電鏡考察。金納米膜的制備及農(nóng)藥的檢測過程見圖1。

圖1 金納米膜的制備及農(nóng)藥的檢測Fig.1 Preparation of gold nanofilms and detection of pesticides

1.4 頂空固相萃取及表面拉曼光譜信號采集與數(shù)據(jù)處理

采用金納米膜在一定溫度下對農(nóng)藥頂空固相萃取15 min后，以激光顯微共焦拉曼光譜儀采集信號。頂空瓶中的氣體濃度通過氣相色譜測定［9－10］。拉曼光譜儀采集參數(shù)：激光波長785 nm，激光能量5 mW，分辨率5 cm－1；單次采集曝光時間2 s，光譜采集范圍500～2 000 cm－1。光譜數(shù)據(jù)采用TQ9.7軟件進行二次處理。

2 結果與討論

2.1 SERS基底的結構特征

圖2 為氧化還原法制備的金納米膜基底的掃描電子顯微（SEM）圖片，結果顯示該金納米膜表面顆粒均勻，具有大量潛在的“熱點”［19］，具有作為SERS基底的潛力。

圖2 金納米膜的SEM圖片F(xiàn)ig.2 SEM photos of gold nanofilm

2.2 地蟲磷與福美鐵的典型SERS光譜圖

圖3 為利用制備的金納米膜對地蟲磷和福美鐵分別進行頂空萃取后得到的典型SERS光譜和分子結構圖。地蟲磷SERS光譜中1 636 cm－1和1 572 cm－1處的特征峰來自于苯環(huán)上C＝C基的伸縮振動；1 074 cm－1和1 023 cm－1處的特征峰來自于苯環(huán)上S—C的伸縮振動和C—H的形變；999 cm－1處的特征峰則來自苯環(huán)形變［20］。對于福美鐵，1 506 cm－1處的特征峰來自CH3搖擺變形和C—N伸縮振動；1 381 cm－1處的特征峰來自CH3形變和C—N伸縮振動；1 146 cm－1處的特征峰來自CH3搖擺和C—N伸縮振動；938 cm－1處的特征峰來自CH3N和C—S的伸縮振動；554 cm－1處的特征峰來自C—S的伸縮振動［19］。這些特征峰指紋圖譜可用于定性判斷地蟲磷和福美鐵，其中以地蟲磷在999 cm－1和福美鐵在1 381 cm－1處的特征峰表現(xiàn)出較高的SERS光譜強度，因此選用這兩個峰分別對地蟲磷和福美鐵進行進一步研究。

圖3 地蟲磷（A）和福美鐵（B）的典型SERS光譜Fig.3 Typical SERS of fonofos（A）and ferbam（B）

2.3 金納米膜的穩(wěn)定性與均一性檢測

圖4 給出了福美鐵（0.05 mg/L）對SERS基底的穩(wěn)定性和均一性檢測結果。圖4A為15個基底上檢測到的福美鐵拉曼光譜瀑布圖；圖4B為福美鐵在同一基底的15個位置特征峰（1 381 cm－1）處的拉曼光譜強度。由圖4A可以看出，本法在15片金納米膜上均可測得福美鐵的3個主要特征峰，峰形和強度較穩(wěn)定。圖4B顯示，同一金納米膜上測得的福美鐵特征峰（1 381 cm－1）強度變化的平均值在10%以內。以上結果說明該基底具有良好的穩(wěn)定性和均一性。

圖4 15個基底上福美鐵的拉曼光譜圖（A）及同一基底上的15個位置在1 381 cm－1處的拉曼強度（B）Fig.4 Raman spectra of ferbam measured on 15 substratums（A），and Raman intensity at 1 381 cm－1 at 15 locations of the same substratum（B）

2.4 金納米膜的增強因子

增強因子（EF）是評價基底SERS性能的重要指標之一。為檢測金納米膜的拉曼光譜增強效果，分別以0.1 mg/L地蟲磷和0.1 mg/L福美鐵為探針，根據(jù)公式EF=ISERS/INormal×cSERS/cNormal計算增強因子［21］。INormal、ISERS分別為增強前后的特征峰強度，cNormal為農(nóng)藥溶液濃度，cSERS為基底表面空氣中的農(nóng)藥濃度（即頂空裝置內基底表面氣體中的農(nóng)藥濃度）。根據(jù)公式計算出EF分別為1.5×104（地蟲磷）和2.7×104（福美鐵），顯示較好的表面增強效果。

2.5 頂空萃取溫度對農(nóng)藥SERS信號的影響

將地蟲磷和福美鐵在不同溫度下頂空萃取，頂空溫度分別為55～85℃、25～70℃，萃取時間15 min，兩者的質量濃度均為0.05 mg/L。實驗發(fā)現(xiàn)：在75℃之前，地蟲磷的SERS信號隨著溫度的升高而逐漸增強，并在75℃達到最大值，當溫度高于75℃后拉曼信號強度下降。在55℃之前，隨著溫度的升高，福美鐵的拉曼信號逐漸增強，55℃時達到最大值，當溫度高于55℃后拉曼信號逐漸下降。這可能是由于隨著溫度的升高，溢出更多的水蒸氣，從而導致拉曼信號降低［22］。另外，福美鐵在25℃下頂空萃取即能檢測出拉曼信號，表明本法具有較好的應用前景。

2.6 頂空萃取時間對農(nóng)藥SERS信號的影響

考察了地蟲磷（0.05 mg/L，75℃）和福美鐵（0.05 mg/L，55℃）在不同頂空萃取時間（5～60 min）下的拉曼光譜圖。發(fā)現(xiàn)頂空萃取5～15 min時，基底吸收量隨著時間的增加而增加，15 min后由于基底吸收量已經(jīng)達到飽和，受蒸氣影響，吸附效果降低，導致SERS信號降低［23］。結果顯示，頂空萃取僅5 min即可檢測出拉曼信號，說明本方法較為靈敏。

2.7 NaCl含量及pH值對農(nóng)藥SERS信號的影響

NaCl可產(chǎn)生鹽析作用，降低分析物在溶液的溶解度，使其更易揮發(fā)，添加適量的NaCl可以增強目標物的拉曼光譜檢測效果［23］，因此對NaCl含量的影響進行考察。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl含量增加，農(nóng)藥的SERS信號強度逐漸增強；NaCl含量為15%時，萃取效果最佳；之后隨著NaCl含量增加，信號強度略有降低。

酸性環(huán)境會腐蝕不銹鋼基底，因此考察了pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0時對SERS檢測的影響。發(fā)現(xiàn)福美鐵在pH 7.0時吸附效果較好，地蟲磷則在pH 6.0時檢測效果較佳。這是因為當溶液呈堿性時，會降低分析物的析出，頂空吸附效果變差［24－25］。

2.8 農(nóng)藥含量對SERS信號的影響及定量分析

考察了農(nóng)藥質量濃度和拉曼光譜強度之間的關系。圖5顯示，在一定農(nóng)藥質量濃度范圍內，拉曼光譜強度隨農(nóng)藥質量濃度的增加而增強。地蟲磷在0.005～0.5 mg/L質量濃度范圍內，可檢測到1 074、1 023、999 cm－1處明顯的SERS指紋圖譜特征峰（圖5A）。福美鐵在0.005～0.1 mg/L范圍內，可檢測到1 381、938、554 cm－1處的特征峰（圖5B）。圖5C顯示，地蟲磷和福美鐵混合液在0.01～0.5 mg/L范圍內時，可檢測到各自的特征峰。

圖5 地蟲磷（A）、福美鐵（B）和地蟲磷、福美鐵混合物（C）的拉曼光譜圖Fig.5 Raman spectra of fonofos（A），ferbam（B）and the mixture of fonofos and ferbam（C）headspace extraction time：15 min，NaCl content：15%；temperature：75℃（fonofos），55℃（ferbam）；pH：6.0（fonofos），7.0（ferbam）；the mixture of fonofos and ferbam：Vfonofos∶Vferbam=1∶1，ρfonofos∶ρferbam=1∶1

對地蟲磷999 cm－1處的特征峰強度（y）與質量濃度（x）進行線性擬合，擬合方程為y=2.357 2x+75.942，相關系數(shù)R2為0.984 8。福美鐵在1 381 cm－1處特征峰強度與質量濃度（x）的擬合方程為y=22.629x－109.68，相關系數(shù)R2為0.977 8。同濃度地蟲磷和福美鐵以等體積混合后，分別對999、1 381 cm－1處的特征峰進行定量分析，地蟲磷和福美鐵的擬合方程分別為yfonofo=1.277 4x+451.87，yferbam=1.883 9x+555.97，相關系數(shù)R2分別為0.926 0、0.984 9，均在0.9以上，說明線性良好。

根據(jù)檢出限（LOD）計算公式［26］：LOD=3.3σ/S（其中σ為空白的標準偏差，S為校準曲線的斜率），計算得到地蟲磷和福美鐵的LOD均為5×10－3mg/L。

2.9 果汁及水中地蟲磷與福美鐵的檢測

圖6 是通過頂空固相萃取和浸泡兩種方式對含有地蟲磷和福美鐵的水和果汁進行檢測得到的拉曼光譜圖。通過頂空固相萃取可以檢測到0.005 mg/L的地蟲磷（圖6A）和福美鐵（圖6B）。浸泡法檢測時，0.05 mg/L的地蟲磷檢測不到有效SERS信號，0.05 mg/L福美鐵則可檢測到有效SERS信號。浸泡法得到的SERS信號強度明顯弱于頂空法。這可能是由于浸泡法檢測時，果汁中其它組分對拉曼光譜信號造成干擾所致。兩種農(nóng)藥混合后，檢測結果類似（圖6C）。無論在水還是果汁中，頂空萃取法都較浸泡法檢測效果更佳。

圖6 地蟲磷（A）、福美鐵（B）及混合液（C）檢測的表面增強拉曼光譜圖Fig.6 Surface-enhanced Raman spectra of fonofos（A），ferbam（B）and mixed solution（C）headspace extraction and dip time：15 min；temperature：75℃（fonofos），55℃（ferbam）

為驗證本方法對地蟲磷和福美鐵檢測的可靠性，對其進行加標回收實驗。分別配制0.1、0.05、0.01 mg/L地蟲磷及0.05、0.02、0.01 mg/L福美鐵的加標果汁樣品，每個加標水平進行3次平行試驗。根據(jù)兩者的線性擬合曲線計算出地蟲磷在999 cm－1處，福美鐵在1 381 cm－1處的回收率分別為93.3%～112%，92.5%～104%，相對標準偏差（RSD）分別為4.1%～5.2%和3.4%～6.5%。表明本法可有效用于地蟲磷和福美鐵的檢測。

3 結論

本文以金納米膜為基底，建立了頂空固相萃取技術結合SERS對揮發(fā)性農(nóng)藥（地蟲磷和福美鐵）進行快速檢測的方法，對地蟲磷和福美鐵頂空固相萃取5 min即可得到拉曼信號；頂空萃取地蟲磷和福美鐵的優(yōu)化條件為：NaCl含量15%、溫度75℃（地蟲磷）和55℃（福美鐵）、pH 6.0（地蟲磷）和pH 7.0（福美鐵）。兩者的LOD均為5×10－3mg/L。使用本方法對果汁中的地蟲磷和福美鐵進行檢測，可檢測到的兩種農(nóng)藥的質量濃度均為0.005 mg/L。該方法操作簡單，高效靈敏，在環(huán)境和食品安全快速檢測方面具有良好的應用前景。相關研究為拉曼光譜在實際檢測中的應用提供了新的思路。