酰胺修飾雜化硅膠整體柱的制備及其在萊克多巴胺檢測中的應用

彭傳云，張少文，馮 勇，吳春來，趙曉潔，宋根娣

（洛陽理工學院 環(huán)境工程與化學學院，河南 洛陽471023）

萊克多巴胺（RAC）屬于人工合成的苯乙醇胺類藥物，是一種“瘦肉精”并作為克倫特羅的替代品被非法添加在飼料中，用來促進動物（如豬、牛、羊等）體內蛋白質含量的提高，使脂肪分解代謝增強，提高瘦肉率［1］。萊克多巴胺在鮮肉及肉制品中殘留，會對人體產生一定毒副作用。我國已明確禁止在動物養(yǎng)殖過程中使用“瘦肉精”，但違法濫用現象時有發(fā)生，因此建立有效的檢測方法對于控制食品安全具有重要意義。

目前檢測萊克多巴胺的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［2］、電化學分析法［3］、高效液相色譜－串聯(lián)質譜法（HPLC－MS）［4－5］和酶聯(lián)免疫法（ELISA）［6－7］等。其中，HPLC法由于具有靈敏、快速、高效和操作方便等優(yōu)點被廣泛應用于萊克多巴胺的檢測。由于肉樣基質成分復雜，影響分析檢測的靈敏度和準確度，在實際樣品檢測中減小基質效應可有效提高檢測的準確度。基質添加標準曲線法和優(yōu)化樣品前處理條件均可有效消除基質效應的影響［8－10］?；|添加標準曲線法是以空白樣品為基質建立標準曲線，降低基質效應［11］。采用固相微萃取技術對實際樣品前處理也是去除基質中雜質的常見方法［12－14］，例如，以聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）整體柱為固相微萃取介質，對豬肉樣品中的β-受體激動劑進行富集，可有效去除豬肉中的基質干擾，對萊克多巴胺的檢出限低至0.5 μg/kg［15］。近年來，有機－無機雜化材料因其較高的萃取效率、機械穩(wěn)定性和易被修飾改性的特性，常用作實際樣品前處理材料［16－19］。分子印跡聚合物復合Fe3O4材料和Fe3O4印跡金屬有機框架MOF－5材料均被用于不同實際樣品（如豬肉、豬肝、尿液、飼料和毛發(fā)）的前處理，實現萊克多巴胺的快速準確檢測［20－21］。

本文利用溶膠－凝膠法制備酰胺修飾氧化瓊脂糖AG/SiO2整體柱，并以此為固相微萃取介質，應用于肉樣中萊克多巴胺的萃取富集，通過優(yōu)化實際樣品前處理條件，結合高效液相色譜－紫外檢測，建立了一種靈敏、可靠的實際樣品中萊克多巴胺的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC－20AT液相色譜儀（日本島津公司）；3－18K臺式高速低溫離心機（德國CHRIST凍干機有限公司）；DY89－1型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技有限公司）；XW－80A旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；LSP04－1A注射泵（河北保定蘭格恒流有限公司）；Bruker vector 22傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，德國Bruker公司）；Philips XL30E掃描電子顯微鏡（SEM，荷蘭Philips公司）；Escalab 250xi X射線光電子能譜（XPS，賽默飛世爾科技有限公司）；ASAP 2020 N2吸附－脫附儀（美國Micromeritics Instruments公司）。

醋酸銨、氨水、磷酸二氫鉀、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、鹽酸、硝酸（分析純，天津市科盟化工工貿有限公司）；過硫酸鉀（K2S2O8）、巰基乙酸（CH3COSH）、瓊脂糖（AG）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、烯丙基縮水甘油醚（AGE）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（分析純，百靈威科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，昌泰興業(yè)有限公司）；冰乙酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氯化碳、石油醚、丙酮（分析純，天津市天力化學試劑有限公司）；正己烷（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；聚乙二醇（PEG，Mw=10 000）、尿素（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；四甲氧基硅烷（TMOS，98%，武漢大學有機硅新材料有限公司）；萊克多巴胺標準品（美國Sigma－Aldrich公司）；熔融石英毛細管（530 μm I.D.，河北永年銳灃色譜器件公司）；實驗用水為超純水；羊肉隨機購自附近超市、農貿市場。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取萊克多巴胺標準品（0.010 0±0.000 5）g，以甲醇溶解并定容至100 mL，即得質量濃度為100 μg/mL的萊克多巴胺儲備液，于4℃下保存?zhèn)溆?。使用時根據需要以相應的空白樣品基質提取溶液配制成適當濃度的標準工作溶液。

1.3 整體柱的制備

毛細管預處理［22］：用1 mol/L NaOH活化毛細管柱，然后分別用0.1 mol/L HCl、水沖洗至中性，氮氣吹干備用。

AG氧化：取1.0 g AG與12 mL 3 mol/L HNO3在60℃水浴加熱下反應6～7 h，即得氧化AG溶液。

AG/SiO2整體柱制備（見圖1A）：采用溶膠－凝膠法制備AG/SiO2整體柱。稱取0.25 g尿素和0.17 g聚乙二醇溶于3 mL氧化AG溶液，在冰水?。?℃）下磁力攪拌2 min，用濃氨水調節(jié)pH至中性，然后在0℃下攪拌2 h，加入1 mL TMOS攪拌30 min后超聲至形成均一溶膠。將其灌裝至處理好的石英毛細管中，用硅膠墊將毛細管兩端封口，40℃下反應20 h，升溫至90℃，保持7～8 h后，降至室溫取出。分別用甲醇、丙酮洗去未反應的化合物，干燥后備用。

酰胺基團功能化修飾過程［23］（見圖1B）：首先取1.0 mL AGE注入制備好的AG/SiO2整體柱中，兩端封口，40℃下反應16 h，利用開環(huán)反應在多糖結構中引入碳碳雙鍵；再將2 mL 0.025 g/mL的K2S2O8和0.000 16 g/mL CH3COSH的混合水溶液注入上述整體柱中，兩端封口，60℃反應24 h，通過巰烯點擊反應進一步引入羧基；最后取1 mL DCC（0.05 g/mL）和NHS（0.014 g/mL）的DMF混合溶液注入上述修飾后的整體柱，兩端封口后于40℃下反應20 h，利用NHS與羧基酰胺化反應對整體柱完成修飾，制得酰胺修飾AG/SiO2整體柱。分別用丙酮和去離子水通入整體柱后，干燥備用。

圖1 酰胺修飾AG/SiO2整體柱的制備過程Fig.1 The preparation procedure of amide group functioned AG/SiO2 monolithic column

1.4 實際樣品制備

取適量羊肉充分絞碎后勻漿，準確稱取2.0 g于25 mL離心管中，加入15 mL乙腈－水（7∶3，體積比）和1 mL乙酸－乙酸銨緩沖溶液（pH 5.6），渦流振蕩10 min，超聲15 min后，于4℃以8 000 r/min離心5 min。取上清液于25 mL離心管中，加入15 mL四氯化碳，靜置30 min后取上清液氮氣吹干，殘留物用2 mL乙腈充分溶解，待上柱凈化。

1.5 固相微萃取過程

以酰胺修飾AG/SiO2整體柱為固相微萃取介質，截取5 cm粘至注射器針頭，用注射泵作為驅動，將溶液推入整體柱中，先用1.0 mL甲醇活化20 min（流速為0.05 mL/min），然后取1.0 mL實際樣品預處理后的上清液通過整體柱萃取20 min（流速為0.05 mL/min），通空氣20 min，再用甲醇－乙酸（9∶1，體積比）洗脫富集在整體柱上的萊克多巴胺0.83 min（流速為0.03 mL/min），取25 μL洗脫液，氮氣吹干后溶解至50 μL水中，用于液相色譜分析。

1.6 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB－C18（4.6 mm×250 mm，4.6 μm）；紫外檢測器檢測波長：276 nm；流動相：0.005 mol/L磷酸二氫鉀水溶液－乙腈（77∶23，體積比），等度洗脫；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：25℃；采集時間：10 min。

2 結果與討論

2.1 整體柱材料的表征

圖2 A為酰胺修飾AG/SiO2整體柱XPS碳元素的1 s電子層能譜（C1s能譜）分析。圖中C―C（284.7 eV）、C―O（285.7 eV）、O====C（286.8 eV）和O====C―N（290.2 eV）4個峰表明經過功能化修飾反應，酰胺基團被修飾至瓊脂糖上。由紅外譜圖（圖2B）可見，經過酰胺基團功能化修飾，在3 332～3 454 cm－1處的吸收峰對應修飾后引入的N―H伸縮振動；2 938 cm－1和2 850 cm－1處的吸收峰分別對應C―H鍵的伸縮振動；1 247 cm－1和1 576 cm－1處的吸收峰對應C―O―C和C―N特征吸收峰，結合1 629 cm－1處C====O伸縮振動的吸收峰，表明AG/SiO2整體柱修飾了酰胺基團。氮氣吸附－脫附等溫曲線如圖2C所示，運用BET吸附模型（Brunauer－Emmett－Teller）計算得到整體柱材料的比表面積為131.7 m2/g，孔徑主要分布在1～2 nm之間。由掃描電鏡照片（圖2D）可見，整體柱材料與毛細管壁鍵合良好，且材料有孔，具有良好的通透性。修飾上酰胺基團［24］和較大的比表面積均有利于萊克多巴胺的富集。

圖2 酰胺修飾AG/SiO2整體柱的XPS譜圖（A）、紅外譜圖（B）、N2吸附－脫附曲線和孔徑分布圖（C），以及SEM掃描電鏡照片（D）Fig.2 XPS spectrum（A），FTIR spectrum（B），N2 adsorption－desorption curve and pore size distribution（C）and SEM image（D）of amide modified AG/SiO2 monolithic column

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化研究表明，選用乙腈為提取溶劑不但可有效沉淀蛋白質，而且對β-受體激動劑有良好的提取效果［25］，同時萊克多巴胺可溶于水，因此實驗分別以乙腈、乙腈－水（9∶1）、乙腈－水（8∶2）、乙腈－水（7∶3）、乙腈－水（6∶4）為提取溶劑，考察了其對添加相同濃度萊克多巴胺肉樣的提取效果。結果顯示，以乙腈－水（7∶3）為提取溶劑時，萊克多巴胺的色譜峰面積最大，提取效率最高，因此選擇乙腈－水（7∶3）作為提取溶劑。

2.2.2 pH值的優(yōu)化樣品溶液pH值對萊克多巴胺的存在狀態(tài)和穩(wěn)定性有一定影響，進而影響整體柱材料與萊克多巴胺的相互作用。實驗考察了pH值分別為4.0、5.2、5.6、6.0、7.0、9.0、10.0和12.0時整體柱對萊克多巴胺萃取效率的影響。結果表明，在pH 5.6時，萊克多巴胺的色譜峰面積最大，提取效率最高，因此實驗選擇在pH 5.6條件下處理肉樣。

2.2.3 萃取與解吸條件的優(yōu)化考察了上樣速率（0.015～0.2 mL/min）對萊克多巴胺萃取效果的影響，結果顯示，萃取后萊克多巴胺的色譜峰面積隨上樣速率的增大而減小，綜合考慮萃取效率和萃取時間，選擇上樣速率為0.05 mL/min。解吸速率也是影響萃取效率的一個重要因素，實驗研究了解吸速率（0.005～0.07 mL/min）對萊克多巴胺提取效率的影響，發(fā)現解吸速率從0.005 mL/min增至0.03 mL/min時萊克多巴胺的色譜峰面積幾乎保持不變，但解吸速率繼續(xù)增加時，萊克多巴胺的色譜峰面積減小，因此選擇最佳解吸速率為0.03 mL/min。在保持其他條件一致的情況下考察了解吸體積（12.5～50 μL）的影響，結果顯示，當解吸體積從12.5 μL增至25 μL時萊克多巴胺的色譜峰面積也隨之增加，但當解吸體積大于25 μL時，其色譜峰面積幾乎不變。表明當解吸體積為25 μL時，富集的萊克多巴胺被完全洗脫，因此選擇最佳解吸體積為25 μL。

2.3 整體柱制備的重現性

以50 ng/mL標準溶液為樣品，在相同的檢測條件下，測定了同批次及不同批次制備的AG/SiO2整體柱對萊克多巴胺的萃取結果，并以相對標準偏差（RSD）評價整體柱制備的重現性。同一批次整體柱檢測的RSD為6.6%，不同批次整體柱檢測的RSD為7.9%，表明整體柱制備的重現性較好。

2.4 分析方法評價

2.4.1 線性范圍及檢出限以空白羊肉為基質，將7個不同濃度的萊克多巴胺標準溶液添加至空白羊肉中（添加量為1.94～1 170 ng/g）。在優(yōu)化的萃取條件下，經整體柱萃取凈化后用高效液相色譜分析，并以標準溶液添加量為橫坐標（x，ng/g），萃取后萊克多巴胺的色譜峰面積為縱坐標（y），每個樣品分別測定3次，繪制標準曲線。結果顯示，萊克多巴胺的線性范圍為1.94～1 170 ng/g，回歸方程為y=5 929.9x+590.04（r2=0.993 1）。分別以3倍和10倍信噪比計算得到方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），LOD和LOQ分別為0.618、1.94 ng/g。

表1 列舉了近年來萊克多巴胺的檢測方法與本方法的比較。結果顯示，本方法對萊克多巴胺的萃取效果較好，檢出限較低，方法靈敏準確。

表1 本方法與其他方法的對比Table 1 Comparison of the established method with other methods

2.4.2 方法準確度與精密度以羊肉為檢測對象，通過標準添加實驗，以加標回收率和RSD分別考察方法的準確度和精密度。萊克多巴胺的加標水平為0.59、1.18、2.35 ng/g，每個加標水平做5個平行實驗。結果表明，3個加標水平下，萊克多巴胺的平均回收率為86.6%～103%，RSD為4.8%～7.3%，方法的準確度和精密度滿足微量檢測需求。加標羊肉樣品的色譜圖見圖3。

圖3 加標0.59 ng/g（a）、1.18 ng/g（b）和2.35 ng/g（c）的羊肉樣品經萃取后的色譜圖Fig.3 Chromatograms of the mutton samples spiked at 0.59 ng/g（a），1.18 ng/g（b）and 2.35 ng/g（c）ractopamine

2.5 實際樣品檢測

采用本文建立的方法對36批次羊肉樣品進行檢測，每個樣品平行測定3次。結果表明，有2批次羊肉中檢出萊克多巴胺，含量分別為0.17、2.51 μg/g，其余樣品中均未檢出。

3 結論

本文以酰胺修飾AG/SiO2整體柱為固相微萃取介質，優(yōu)化了樣品前處理條件，建立了肉樣中萊克多巴胺的HPLC－UV檢測方法。結果表明，實際樣品經乙腈－水（7∶3）提取及乙酸－乙酸銨緩沖溶液（pH 5.6）處理，提取液經整體柱萃取后，可有效去除樣品中的復雜基質，實現對萊克多巴胺的凈化和富集。所建立的檢測方法在1.94～1 170 ng/g范圍內呈良好的線性關系，r2為0.993 1，LOD為0.618 ng/g，LOQ為1.94 ng/g。加標回收率為86.6%～103%，RSD為4.8%～7.3%。該方法具有檢出限低、回收率高、樣品用量少等特點，并成功應用于羊肉中萊克多巴胺的檢測，可為肉樣中痕量“瘦肉精”的檢測提供技術支持。