牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定*

王宣剛 孔祥福 王欣桐 李恒順 劉金相,2 王志剛 于海洋①

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266003;2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266237)

巨噬細(xì)胞是一類由血液中的單核細(xì)胞遷移到組織中發(fā)育而來、在生物體免疫反應(yīng)中具有重要意義的白細(xì)胞，它不僅在清除、呈遞抗原中發(fā)揮重要作用，還能通過釋放大量免疫因子參與宿主防御和炎癥反應(yīng)(Fujiwaraet al, 2005; Johnston, 1988)。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)多種病原菌能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生依賴于caspase-1的程序性死亡——細(xì)胞焦亡，以自我裂解的方式釋放入侵到細(xì)胞中的病原體，使其被免疫細(xì)胞或因子清除(Broz, 2015; Jorgensenet al, 2015)。頭腎是魚類所特有的、由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和淋巴組織構(gòu)成的重要免疫器官(藍(lán)軍南等, 2020)，在使用鞭毛蛋白、LPS、poly I:C 對頭腎細(xì)胞進(jìn)行刺激后，頭腎中與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-1β、IL-10和TNF-α等均出現(xiàn)顯著上調(diào) (Chettriet al, 2011)。頭腎中含有包括單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等在內(nèi)的眾多白細(xì)胞，且獲得方便、后續(xù)操作簡便，是分離巨噬細(xì)胞的理想材料。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國重要的海水增養(yǎng)殖魚類，近年來，牙鲆高密度集約化的養(yǎng)殖方式加速了細(xì)菌、病毒等病原體的傳播速度，使得病害頻發(fā)，嚴(yán)重限制了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。對牙鲆的免疫系統(tǒng)及免疫反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行細(xì)致深入的研究，可以針對不同病原體研制出相應(yīng)的有效對策，從而對疾病進(jìn)行預(yù)防與控制，減少養(yǎng)殖中的經(jīng)濟(jì)損失。熒光定量PCR及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，牙鲆感染遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)前后腎臟中CD40基因表達(dá)量顯著上調(diào)(Liuet al, 2017)，而CD40是廣泛表達(dá)在巨噬細(xì)胞中的基因(Machet al, 1997)，提示巨噬細(xì)胞在牙鲆抵抗遲緩愛德華氏菌中可能發(fā)揮一定作用。巨噬細(xì)胞作為牙鲆先天性免疫的重要組成成分，在免疫學(xué)中一直是研究的熱點(diǎn)，但巨噬細(xì)胞不能繁殖(Boltonet al, 2004)，常用原代巨噬細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此，建立其分離鑒定技術(shù)對于研究牙鲆先天性免疫具有重要意義。

近年來，魚類巨噬細(xì)胞分離技術(shù)已趨于成熟，各組織巨噬細(xì)胞的分離方法相繼建立，分別從魚類的頭腎、脾臟、外周血、腸和腹腔中成功分離得到了巨噬細(xì)胞(Ganassinet al, 1998; Olivieret al, 1986; S?rensenet al, 1997; Shaet al, 2017; 陶會竹等, 2018)。從半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)的外周血中通過密度梯度離心獲得單核細(xì)胞并培養(yǎng)至巨噬細(xì)胞，并對細(xì)胞的吞噬能力和部分基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(Shaet al,2017)。陶會竹等(2018)從草魚(Ctenopharyngodon idellus)的腸中分離得到了巨噬細(xì)胞，電鏡及吉姆薩染色顯示其具備巨噬細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，并具備吞噬功能。但總體而言，關(guān)于海水硬骨魚類，特別是鲆鰈類的巨噬細(xì)胞分離和鑒定的報(bào)道還比較匱乏。本研究使用牙鲆頭腎為材料，分離巨噬細(xì)胞，并摸索細(xì)胞培養(yǎng)條件，確定適于牙鲆巨噬細(xì)胞生長的培養(yǎng)基成分，并使用巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記分子mpeg1基因?qū)?xì)胞類型進(jìn)行鑒定(Ellettet al, 2011)，旨在為開展牙鲆巨噬細(xì)胞相關(guān)研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用1 齡牙鲆(體重為550～1100 g)購自山東青島南山市場，購回后所有牙鲆均養(yǎng)殖于18℃～20℃的海水中，每天飼喂商業(yè)飼料至實(shí)驗(yàn)使用。

牙鲆鰓細(xì)胞系(FG9307)和卵巢細(xì)胞系從中國海洋大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室獲得；淋巴細(xì)胞為使用外周血淋巴細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)按照說明書步驟從牙鲆外周血中分離得到。

青-鏈霉素與L-15 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；吉姆薩染液、TRIzol 購自北京索萊寶科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR試劑、p-EASY 連接體系及DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；單核細(xì)胞分離試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。

1.2 牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前，將牙鲆用MS-222 麻醉，將其轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)臺上，用酒精擦拭魚身進(jìn)行消毒，隨后用高溫滅菌的手術(shù)剪從牙鲆的泄殖孔將其腹腔剪開，小心取出頭腎，并將其立即放入含有3%雙抗的PBS 緩沖液中。在超凈臺中用含1%雙抗的PBS 將頭腎反復(fù)沖洗5 遍以上，洗去頭腎表面的血污及可能沾染的細(xì)菌。洗凈的頭腎用眼科剪無菌操作剪成1 mm3的小塊，為防止此過程造成的組織干燥而影響下一步細(xì)胞的分離，可在剪的過程中添加少許PBS 緩沖液浸潤組織。將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移到70 μm 的細(xì)胞篩上，一邊輕輕按壓組織塊，一邊少量多次地添加PBS，直至所有組織塊都從篩網(wǎng)漏下，得到頭腎的單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，20℃ 500g離心10 min，棄上清液。采用單核細(xì)胞分離試劑盒中附帶的樣本稀釋液將離心后得到的細(xì)胞沉淀重懸，取一支干凈的離心管，按3∶1 的比例分別加入試劑盒中的分離液1和分離液2，加樣過程要避免破壞分層。在最上層加入重懸后的細(xì)胞懸液(與分離液1、2 體積之和的比為1∶2)，隨后在20℃ 500 g 條件下離心30 min。離心后吸取富含巨噬細(xì)胞的上層灰白色細(xì)胞層至新離心管，加入PBS 緩沖液輕輕吹打?qū)?xì)胞進(jìn)行清洗，隨后20℃ 200 g 離心10 min，棄上清液。使用PBS 重復(fù)對細(xì)胞清洗1 次。

分別使用DMEM/F12 (1∶1)、RPMI1640、L-15(Gibco)培養(yǎng)基和其他公司生產(chǎn)的L-15 培養(yǎng)基及1%、5%、10%濃度的胎牛血清配制成不同組分的培養(yǎng)基，各組均加入1%青-鏈霉素、1%非必需氨基酸、30%L929 細(xì)胞培養(yǎng)基，摸索適合牙鲆巨噬細(xì)胞生長的培養(yǎng)基及血清條件。得到的細(xì)胞沉淀用相應(yīng)培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞密度調(diào)至5×106個(gè)/mL，使用臺盼藍(lán)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率。將調(diào)整密度后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24℃下培養(yǎng)4 h 后洗去未貼壁的細(xì)胞，即得到純度較高的巨噬細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡及倒置顯微鏡下對細(xì)胞拍照，比較不同類型培養(yǎng)基及血清濃度對牙鲆巨噬細(xì)胞生長的影響。細(xì)胞在24℃不含CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)用生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，直至取用。

1.3 牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞的吉姆薩染色

使用細(xì)胞刮小心刮取培養(yǎng)在6 孔板中的牙鲆巨噬細(xì)胞，用PBS 緩沖液清洗1 遍，200 g 離心10 min后棄上清液，加入PBS 緩沖液重懸，吸取部分細(xì)胞懸液制成血涂片，自然風(fēng)干后滴加吉姆薩染液染色15 min，隨后洗去染液，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.4 細(xì)胞RNA 的提取和cDNA 的合成

使用TRIzol 對牙鲆巨噬細(xì)胞消化后按照說明書提取細(xì)胞中的RNA，使用gDNA Eraser 試劑盒對RNA反轉(zhuǎn)錄及合成cDNA。

1.5 牙鲆巨噬細(xì)胞中mpeg1 基因的擴(kuò)增與鑒定

利用實(shí)驗(yàn)室已有的牙鲆基因組，通過本地blast獲得牙鲆mpeg1基因序列，在IDT 網(wǎng)站(https://sg.idtdna.com/pages)在線設(shè)計(jì)該基因的特異性引物，擴(kuò)增其ORF 區(qū)段，引物序列：mpeg1-Fw(5'-GTCATGAA GACAGCAGTG-3'；mpeg1-Rv(5'-CTTGTGTCTGGGA CAAAC-3')，以上一步得到的cDNA 為模板，使用北京全式金生物的TransStart?FastPfu DNA Polymerase進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 體系：5×TransStart?FastPfu buffer 5 μL，dNTP (10 mmol/L) 2 μL，模板1 μL，正、反向引物各0.5 μL，TransStart?FastPfu DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 15.5 μL，共25 μL。反應(yīng)程序：95℃2 min；95℃ 20 s，52℃ 20 s，72℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，使用2%瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行檢測，切膠回收后與pEASY?-Blunt Simple 載體連接，轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后培養(yǎng)，選取陽性克隆菌株送華大基因測序。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

將分離得到的牙鲆巨噬細(xì)胞經(jīng)在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)4 h，洗去未貼壁的細(xì)胞，顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)(圖1)，多數(shù)細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，細(xì)胞多呈卵圓形、橢圓形等。臺盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞存活率為99.62%。培養(yǎng)7 d 后，大多數(shù)細(xì)胞仍保持貼壁狀態(tài)，狀態(tài)良好。

圖1 倒置顯微鏡觀察到的牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞Fig.1 Photomicrograph of macrophages derived from head kidney of Japanese flounder

2.2 牙鲆巨噬細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化

為了確定適合體外培養(yǎng)牙鲆巨噬細(xì)胞的條件，使用不同培養(yǎng)基及不同濃度的血清對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)了細(xì)胞在不同條件下培養(yǎng)的貼壁比率。在培養(yǎng)基選擇上，比較了DMEM/F12 (1∶1)培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、L-15(Gibco)培養(yǎng)基以及其他公司生產(chǎn)的L-15培養(yǎng)基；在血清濃度選擇上，向相同的培養(yǎng)基中分別添加了1%、5%和10%的胎牛血清，以摸索合適的血清濃度。不同類型培養(yǎng)基及不同濃度血清培養(yǎng)的細(xì)胞均培養(yǎng)在24℃不含CO2的培養(yǎng)箱中。在使用不同條件培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)每孔中貼壁細(xì)胞的數(shù)量，以探究不同條件對細(xì)胞貼壁程度的影響。胎牛血清濃度為5%時(shí)不同類型培養(yǎng)基對牙鲆巨噬細(xì)胞貼壁的影響見圖2。為了使結(jié)果更為直觀，定義貼壁最多組細(xì)胞的貼壁率為100%，用每組貼壁細(xì)胞的數(shù)量比貼壁最多組細(xì)胞的數(shù)量得到其余各組的貼壁率，通過折線圖反映不同培養(yǎng)基及不同濃度血清對牙鲆巨噬細(xì)胞培養(yǎng)的影響(圖3)。結(jié)果顯示，L-15(Gibco)培養(yǎng)基比較適合用來培養(yǎng)牙鲆巨噬細(xì)胞，該條件下細(xì)胞貼壁數(shù)量較多。此外，與其他2 個(gè)濃度組相比，含5%血清的培養(yǎng)基中細(xì)胞生長狀態(tài)最好，而含1%和10%血清的培養(yǎng)基中細(xì)胞貼壁數(shù)量較少。

圖2 使用不同類型培養(yǎng)基對牙鲆巨噬細(xì)胞培養(yǎng)的顯微鏡觀察結(jié)果Fig.2 Photomicrograph of macrophages of Japanese flounder cultured with different types of medium

圖3 使用不同類型培養(yǎng)基及不同濃度血清對牙鲆巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后細(xì)胞的貼壁率Fig.3 Adhesion rate of macrophages of Japanese flounder cultured with different types of media and different concentrations of serum for 24 h

此外，貼壁效果較好的L-15 (Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞7 d 后的貼壁比率結(jié)果顯示(圖4)，細(xì)胞狀態(tài)較為平穩(wěn)，直至培養(yǎng)7 d 時(shí)，貼壁率仍保持在80%以上。

圖4 使用L-15(Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)的牙鲆巨噬細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的貼壁率Fig.4 Adhesion rate of macrophages of Japanese flounder cultured with L-15(Gibco) media at different time points

2.3 牙鲆巨噬細(xì)胞的吉姆薩染色

如圖5 所示，經(jīng)吉姆薩染色后觀察發(fā)現(xiàn)，分離得到的細(xì)胞體積較大，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核被染成紫紅色，較大且偏向一側(cè)，與報(bào)道中草魚(陶會竹等,2018)、半滑舌鰨(Shaet al, 2017)巨噬細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，符合巨噬細(xì)胞特征。

圖5 牙鲆巨噬細(xì)胞的吉姆薩染色結(jié)果Fig.5 Macrophages of Japanese flounder stained by Giemsa

2.4 牙鲆巨噬細(xì)胞中mpeg1 基因的擴(kuò)增

以牙鲆巨噬細(xì)胞cDNA 為模板，對mpeg1基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，并以牙鲆淋巴細(xì)胞、鰓細(xì)胞和卵巢細(xì)胞為陰性對照，使用各模板擴(kuò)增了牙鲆的β-actin基因。如圖6 所示，4 種模板均擴(kuò)增出β-actin條帶，而只有牙鲆巨噬細(xì)胞中擴(kuò)增出與mpeg1的ORF 區(qū)段大小接近的條帶，該條帶的測序結(jié)果顯示，此序列包含的ORF 序列與牙鲆mpeg1基因ORF 區(qū)相似度達(dá)99.86%，僅有3 個(gè)堿基發(fā)生突變，可認(rèn)為分離得到的細(xì)胞中表達(dá)mpeg1基因。

圖6 牙鲆巨噬細(xì)胞中mpeg1 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Amplification of mpeg1 in macrophages of Japanese flounder

3 討論

巨噬細(xì)胞在以先天性免疫為主的硬骨魚中發(fā)揮重要作用，具有呈遞抗原、殺滅和清除入侵病原體的功能，建立完備的巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)對于研究巨噬細(xì)胞的特性及其在免疫應(yīng)答中的作用具有重要意義。頭腎作為魚類重要的免疫器官，富含巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，是分離巨噬細(xì)胞的良好材料。近年來，關(guān)于從硬骨魚頭腎中分離巨噬細(xì)胞的研究較多，Teles 等(2011)從虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的頭腎中獲得了巨噬細(xì)胞，但單細(xì)胞懸液中紅細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)高于巨噬細(xì)胞，不經(jīng)離心分選便進(jìn)行貼壁培養(yǎng)使獲得的巨噬細(xì)胞數(shù)量較少，難以滿足實(shí)驗(yàn)的需求；Li 等(2013)通過Percoll 法從大黃魚(Larmichthys crocea)的頭腎中分離到巨噬細(xì)胞，使用L-15 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并利用差速貼壁法純化細(xì)胞。此外，還有研究人員從紅鯉(Cyprinus flammans) (Yanget al, 2015)、大西洋鱈魚(Gadus morhua) (S?rensenet al, 1997)和鯉魚(Cyprinus carpio) (Joerinket al, 2006)的頭腎中分離出巨噬細(xì)胞。

本研究采用機(jī)械法獲取了牙鲆頭腎的單細(xì)胞懸液。常用的方法還有使用胰蛋白酶、膠原蛋白酶對組織進(jìn)行解離的酶消化法，該方法對酶的濃度和消化時(shí)間要求較為嚴(yán)格，酶的濃度不夠、消化時(shí)間過短容易造成組織無法消化成單個(gè)細(xì)胞，后續(xù)得到的細(xì)胞少，而酶濃度過高、消化時(shí)間過長則會對細(xì)胞造成傷害。對于不同物種的不同組織需要一系列的實(shí)驗(yàn)摸索才能確定合適的消化條件；而機(jī)械法是將剪碎的組織塊輕輕按壓，使其通過細(xì)胞濾網(wǎng)從而獲得單細(xì)胞懸液，避免了因酶濃度不適宜而引起后續(xù)結(jié)果不理想的弊端，更為穩(wěn)定簡單。隨后通過離心獲得與巨噬細(xì)胞大小接近的細(xì)胞層，但這些細(xì)胞中仍含有少數(shù)淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞。與哺乳動物不同，魚類作為低等脊椎動物，成熟的紅細(xì)胞中也含有細(xì)胞核，而紅細(xì)胞裂解液是根據(jù)成熟紅細(xì)胞無細(xì)胞核來對其進(jìn)行裂解的，因此，無法使用紅細(xì)胞裂解液來清除魚類紅細(xì)胞。根據(jù)Li 等(2013)的方法，利用巨噬細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)貼壁而其他細(xì)胞不能貼壁的特性，在培養(yǎng)4 h 后，將未貼壁的細(xì)胞洗去，通過差速貼壁法分離，對得到的巨噬細(xì)胞進(jìn)行一定程度的純化。

本研究中，嘗試使用不同方法培養(yǎng)細(xì)胞，并比較細(xì)胞生長狀態(tài)以確定適于培養(yǎng)牙鲆巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基成分。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，相較于其他類型的培養(yǎng)基，L-15(Gibco)培養(yǎng)基更適于牙鲆巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞貼壁率較高，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞狀態(tài)保持良好。王秋華等(2011)在其他硬骨魚中也使用L-15 培養(yǎng)基，考慮可能L-15 培養(yǎng)基中的成分更能滿足硬骨魚巨噬細(xì)胞生存的需求。關(guān)于羅非魚(Oreochroms mossambcus)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)的研究顯示，使用10%胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞僅少數(shù)貼壁，5%胎牛血清和5%魚血清組的細(xì)胞部分貼壁，10%魚血清組的細(xì)胞大部分貼壁，表明不同血清對羅非魚巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)有較大影響，魚血清更有利于其巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)(王秋華等, 2011)。本研究結(jié)果顯示，僅添加胎牛血清便足以維持牙鲆巨噬細(xì)胞的體外正常生長，且5%濃度的血清比1%和10%濃度更適于細(xì)胞培養(yǎng)。Hume 等(2012)研究表明，巨噬細(xì)胞集落因子CSF-1 對促進(jìn)單核細(xì)胞增殖分化及維持巨噬細(xì)胞存活具有重要作用，而小鼠成纖維細(xì)胞L929 在生長的過程中可向培養(yǎng)基中分泌巨噬細(xì)胞集落因子。因此，本研究添加L929 細(xì)胞的培養(yǎng)基來培養(yǎng)巨噬細(xì)胞以維持其正常狀態(tài)。

此外，本研究從細(xì)胞形態(tài)及巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記兩方面對牙鲆巨噬細(xì)胞進(jìn)行鑒定。吉姆薩染色顯示，與半滑舌鰨及草魚的巨噬細(xì)胞類似(Shaet al, 2017;陶會竹等, 2018)，本研究分離得到的細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核染色較深，呈卵圓形或腎形，偏向細(xì)胞一側(cè)，符合巨噬細(xì)胞形態(tài)特征；對于基因標(biāo)記，常使用流式細(xì)胞儀來識別哺乳動物的特異性標(biāo)記，從而鑒定細(xì)胞類型，但在硬骨魚中較難實(shí)現(xiàn)。本研究選取mpeg1基因這一巨噬細(xì)胞特異性分子標(biāo)記對細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定，在牙鲆巨噬細(xì)胞中成功擴(kuò)增出該基因，且在陰性對照組中無法擴(kuò)增，進(jìn)一步證明本研究分離得到的細(xì)胞為巨噬細(xì)胞(Ellettet al, 2011)。

本研究建立了一種分離鑒定牙鲆巨噬細(xì)胞的方法，篩選得到了適合培養(yǎng)牙鲆巨噬細(xì)胞的條件，為下一步體外研究牙鲆免疫反應(yīng)提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料，為后續(xù)開展牙鲆免疫應(yīng)答相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。