鄭鈞倫，羅 瓊，李子彤，門淑珍

(南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 南開 300071)

0 引言

生長素(auxin)廣泛存在于各種植物中，是最早在植物體被發(fā)現(xiàn)并進行研究的激素之一。雖然結(jié)構(gòu)簡單，但其能實現(xiàn)的功能卻十分復(fù)雜，在植物生長和發(fā)育的許多過程中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。生長素通過在不同的組織建立濃度梯度影響植物細胞的伸長、分裂與分化等過程，從而調(diào)節(jié)植株的向重力性和向光性生長，調(diào)控植物組織器官的發(fā)育和分化，如胚的形成、器官發(fā)生和形態(tài)建成、花芽的萌發(fā)以及果實的發(fā)育與成熟等[1，2]。一般認(rèn)為，生長素在莖尖、根尖和正在發(fā)育的幼葉等生長活躍的組織中合成，通過維管系統(tǒng)以被動運輸或主動運輸?shù)姆绞竭\送至目標(biāo)組織和器官。研究表明，植物產(chǎn)生生長素濃度梯度主要是通過主動運輸，該運輸方式就是生長素所特有的極性運輸(polar auxin transport，PAT)機制。

在極性運輸?shù)淖饔孟?，植物的一些發(fā)育特性開始出現(xiàn)，比如維管發(fā)生、頂端優(yōu)勢和向性生長等等[2]。一般生長素在植物中的極性運輸主要指莖尖向莖基部，以及莖基向根部的運輸。進一步的研究表明，生長素極性運輸除了上述運輸途徑外，還包括在組織內(nèi)部的局部定向運輸，例如生長素在根的表皮細胞和側(cè)根冠細胞中的向基(從根尖向根基部)運輸及其通過皮層細胞向根尖的回流[3,4]。

生長素濃度梯度分布決定了植物的生長發(fā)育模式，而生長素的轉(zhuǎn)運蛋白對于生長素的梯度分布起著關(guān)鍵作用。因此，對生長素極性運輸?shù)妮d體蛋白及其調(diào)節(jié)機制的研究是生長素研究的熱點。截至現(xiàn)在，人們已經(jīng)鑒定出幾種生長素轉(zhuǎn)運蛋白，包括AUXIN1/LIKE-AUX1(AUX / LAX)、PIN-FORMED(PIN)、ABCB(ATP-binding cassette transporters B sub-family)轉(zhuǎn)運蛋白和類PIN蛋白(PIN-LIKES，PILS)轉(zhuǎn)運蛋白[3,5]。這些生長素的載體蛋白根據(jù)亞細胞定位及功能不同可分成兩類：一類定位于細胞質(zhì)膜，作為生長素的輸入或輸出載體負責(zé)細胞間的生長素極性運輸，包括AUX/LAX家族蛋白、大部分PIN家族蛋白以及ABCB轉(zhuǎn)運蛋白；另一類主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，維持細胞內(nèi)生長素的穩(wěn)態(tài)[3]，包括PILS以及PIN蛋白的短鏈亞族成員。

PIN蛋白由兩側(cè)的疏水區(qū)與一個位于中央的親水區(qū)構(gòu)成。研究最多的是擬南芥AtPIN家族，有8個成員(AtPIN1-AtPIN8)，由于最先發(fā)現(xiàn)的atpin1突變體花序呈針狀(pin-formed)而得名。后根據(jù)親水環(huán)長度及亞細胞定位不同將其分為三個亞族：第一類包括AtPIN1-AtPIN4 和AtPIN7，它們都具有長的親水環(huán)，極性定位于質(zhì)膜；第二類包括AtPIN5和AtPIN8，具有短的親水環(huán)，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；AtPIN6屬于第三類，其具有較長的親水環(huán)，具有質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的雙重定位[5,6]。研究表明，PIN基因家族是從同一祖先基因進化而來，其成員之間的蛋白結(jié)構(gòu)的差異主要來自于其中央親水環(huán)的差異，并通過對中央親水環(huán)不同的磷酸化位點修飾使AtPIN蛋白家族成員功能各異[6-8]。長鏈家族的AtPIN1-AtPIN4以及AtPIN7的功能研究比較深入，它們都極性定位于細胞膜，將胞內(nèi)的生長素運輸至細胞外，形成與維持組織中生長素的濃度梯度[2-5,9]。PIN1蛋白主要定位于維管組織細胞的底部細胞膜，參與生長素的極性運輸，同時影響器官發(fā)生、維管分化、花芽和葉脈的形成[2-5,9]；PIN2蛋白在根尖伸長區(qū)和胚中表達，也參與極性運輸，調(diào)控植物的向重力生長[10]。PIN1、PIN3、PIN4和PIN7蛋白也參與根的向重力生長和莖的負向重力生長[11]。此外，PIN3和PIN4蛋白還參與控制植物的向光性生長，并與早期側(cè)根的發(fā)育有關(guān)[12]。PIN5蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，負責(zé)生長素從胞質(zhì)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運輸，通過調(diào)節(jié)細胞質(zhì)內(nèi)的生長素濃度而參與側(cè)根生長、早期胚的發(fā)生以及根與子葉的生長等一系列與生長素調(diào)控有關(guān)的植物發(fā)育過程[13]；PIN6蛋白由于磷酸化作用的影響，使它既可以定位于細胞膜也可以定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過兩種定位方式來同時調(diào)節(jié)胞內(nèi)外的生長素極性運輸與胞質(zhì)間的生長素動態(tài)平衡， PIN6蛋白也參與了由生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)決定的植物發(fā)育過程，如主/側(cè)根的發(fā)育和生長、根毛的生長以及頂端優(yōu)勢的形成等等[14]。PIN8蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與花粉、雄配子體以及孢子體的形成[15]。

迄今為止，人們已經(jīng)通過全基因組測序在三十余種植物中鑒定出PIN基因家族，成員數(shù)目在4(地錢，Marchantiapolymorpha)至23(大豆，Glycinemax)之間[3]。遺傳學(xué)分析證明，在進化過程中的基因組重復(fù)是導(dǎo)致PIN基因在不同物種中的數(shù)量差異的主要原因。盡管人們對PIN蛋白家族的研究在不斷深入，許多植物的PIN基因也不斷被發(fā)現(xiàn)，但一些需要受到研究關(guān)注的植物卻一直沒有研究。蓖麻(RicinuscommunisL.)是大戟科(Euphorbiaceae)蓖麻屬(Ricinus)下的唯一物種。它原產(chǎn)于非洲，目前在中國、印度和巴西均有大面積栽培。作為世界十大油料作物之一，蓖麻產(chǎn)出的蓖麻籽可以用于提煉榨取蓖麻油,其不僅可以作為生物柴油，而且還是化工領(lǐng)域中重要的原材料之一。在人類對生態(tài)環(huán)境保護日益重視的今天，由于蓖麻的含油量高、油質(zhì)好且具有一定的可再生性，被認(rèn)為是最有希望的石油替代者[16]。

本研究以功能已基本明確的擬南芥PIN蛋白家族序列為參考，在蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫中檢索蓖麻編碼PIN蛋白的同源基因序列，并通過生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析目的基因的序列信息，以及該基因家族的進化關(guān)系和保守基序特征，旨在為將來開展蓖麻PIN蛋白家族的生物學(xué)功能研究提供參考信息，為蓖麻生長素的極性運輸機制研究奠定基礎(chǔ)，為蓖麻種植行業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 實驗材料

蓖麻種子由南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的李秀蘭老師提供，于南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院試驗田種植。剪取水培蓖麻幼苗的根、土中正常生長植株二葉期的莖和葉、盛花期植株的雌花、雄花和果實組織用于提取表達分析所用的總RNA。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成。采用北京全式金生物技術(shù)有限公司RNA提取試劑盒(ET121)提取蓖麻各組織材料的總RNA。采用北京全式金生物技術(shù)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AE301)合成cDNA第一鏈。

1.2.2RcPIN基因在蓖麻各組織的表達。以上述獲得的cDNA為模板，利用RcPIN基因的特異引物進行RT-PCR。利用蓖麻的RcACTIN7基因作為內(nèi)參。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.3 生物信息學(xué)分析工具。實驗使用的序列數(shù)據(jù)來自于TAIR數(shù)據(jù)庫、NCBI數(shù)據(jù)庫和Phytozome數(shù)據(jù)庫。通過生物信息學(xué)手段分析蓖麻中編碼PIN蛋白的同源基因，使用的生物信息學(xué)分析工具如表2。

表2 生物信息學(xué)分析工具

2 實驗結(jié)果

2.1 蓖麻PIN蛋白家族的序列分析

為了檢索蓖麻中編碼PIN蛋白的同源序列，以擬南芥的8條PIN蛋白序列為模板，在蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫中進行比對，刪除掉得分較低的亞型，共獲得7條蓖麻PIN蛋白序列，對其逐一進行分析。

理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，蓖麻PIN蛋白平均長度約為537個氨基酸殘基，平均分子量為58.64 ku。編碼氨基酸最長的是RcPIN3蛋白，長度為646個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為70.39 ku；編碼氨基酸最短的是RcPIN8蛋白，長度為356個氨基酸，預(yù)測分子量為39.05 ku。蓖麻PIN蛋白的理論等電點變化范圍在8.17(RcPIN3)至9.52(RcPIN8)之間，均大于7，平均理論等電點為8.84，結(jié)果如表3所示。不穩(wěn)定系數(shù)分析結(jié)果顯示，RcPIN1-1、RcPIN1-2、RcPIN2、RcPIN3、RcPIN5、RcPIN6、RcPIN8蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，為穩(wěn)定蛋白。它們的脂溶指數(shù)都較高，證明它們脂溶性較好。親水性系數(shù)分析結(jié)果顯示，根據(jù)親水性系數(shù)正值為親水性，負值為疏水性，介于-0.5至+0.5之間為兩性蛋白的原則[39]，RcPIN5、RcPIN8蛋白為疏水性蛋白，其余蛋白均為兩性蛋白。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，除了RcPIN5、RcPIN8只有一個Mem_trans保守結(jié)構(gòu)域外，其余PIN蛋白均具有兩個Mem_trans保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如表3所示。

表3 蓖麻PIN蛋白家族成員信息

通過比對擬南芥和蓖麻的PIN蛋白序列，構(gòu)建進化樹，然后進行基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，擬南芥與蓖麻聚集到一起的基因均有較為相似的基因結(jié)構(gòu)，如圖1所示。RcPIN1-1、RcPIN1-2與AtPIN1均有5個內(nèi)含子，6個外顯子。AtPIN2有8個內(nèi)含子，9個外顯子，而RcPIN2有5個內(nèi)含子，6個外顯子。RcPIN3、AtPIN3、AtPIN4和AtPIN7均有5個內(nèi)含子，6個外顯子。RcPIN5和AtPIN5均有4個內(nèi)含子，5個外顯子。RcPIN6與AtPIN6均有6個內(nèi)含子，7個外顯子。AtPIN8與RcPIN8均有5個內(nèi)含子，6個外顯子。

圖1 擬南芥與蓖麻PIN蛋白家族的進化關(guān)系與基因結(jié)構(gòu)

對蓖麻PIN蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果如表4所示。從二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可以看出，它們的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成。其中RcPIN1-1、RcPIN1-2、RcPIN2、RcPIN3和RcPIN6的二級結(jié)構(gòu)的數(shù)量表現(xiàn)為無規(guī)則卷曲>α螺旋>延伸鏈>β轉(zhuǎn)角，而RcPIN5和RcPIN8則表現(xiàn)為α螺旋>無規(guī)則卷曲>延伸鏈>β轉(zhuǎn)角，β轉(zhuǎn)角是這些蛋白中數(shù)量最少的結(jié)構(gòu)。

表4 蓖麻PIN蛋白家族的二級結(jié)構(gòu)

PIN蛋白主要負責(zé)將生長素轉(zhuǎn)運至胞外，是植物細胞重要的跨膜蛋白，因此跨膜結(jié)構(gòu)域是其重要特征?？缒そY(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，所有AtPIN家族與RcPIN家族成員均有N端和C端兩個疏水區(qū)域(5次跨膜)和一個中央的親水環(huán)(圖2)。親水環(huán)結(jié)構(gòu)位于細胞內(nèi)。RcPIN1-1、RcPIN1-2、RcPIN2、RcPIN3以及RcPIN6蛋白的親水環(huán)較長，而RcPIN5和RcPIN8蛋白的親水環(huán)較短。分別與AtPIN1、AtPIN2、AtPIN3、AtPIN6、AtPIN5以及AtPIN8對應(yīng)，拓撲結(jié)構(gòu)相似性非常高(圖2)。

圖2 擬南芥與蓖麻PIN蛋白家族的跨膜結(jié)構(gòu)域

使用SignalP 5.0在線工具預(yù)測擬南芥與蓖麻PIN蛋白的信號肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這15個PIN蛋白均不存在信號肽(分析結(jié)果未展示)，暗示PIN蛋白不會向細胞外表達，為非分泌性蛋白。PIN蛋白的磷酸化對其細胞膜極性定位和轉(zhuǎn)運活性有重要影響，因此，使用NetPhos 3.1在線工具分析了擬南芥與蓖麻PIN蛋白的磷酸化位點。結(jié)果顯示，與擬南芥類似，蓖麻PIN蛋白的磷酸化位點也大多分布于蛋白序列中間的親水環(huán)區(qū)域，潛在的磷酸化位點多數(shù)為絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基，少數(shù)為酪氨酸殘基(圖3)。

圖3 擬南芥與蓖麻PIN蛋白家族的磷酸化位點預(yù)測

使用Mafft Version 7在線工具進行序列比對后用Jalview軟件繪制出序列比對分析圖，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，PIN家族蛋白的兩端跨膜結(jié)構(gòu)域較為保守，而構(gòu)成中央親水環(huán)的氨基酸序列差異較大。

2.2 蓖麻PIN基因家族的系統(tǒng)進化分析

選擇雙子葉植物煙草，大戟科的木薯、橡膠樹和麻風(fēng)樹，單子葉植物水稻和玉米作為分析對象，與蓖麻和擬南芥PIN蛋白序列一起置于MEGA7.0軟件中使用鄰接法構(gòu)建進化樹。結(jié)果顯示，蓖麻與同科的木薯、橡膠樹和麻風(fēng)樹聚在一起，表示PIN蛋白在大戟科植物中序列比較保守。擬南芥和煙草等雙子葉植物聚攏于一起，而單子葉植物水稻和玉米聚攏于一起。此結(jié)果與植物分類學(xué)一致，結(jié)果如圖5所示。

2.3 蓖麻PIN基因的表達分析

為了初步研究所篩選出的PIN蛋白的功能，我們首先利用蓖麻基因表達數(shù)據(jù)庫(RcDB，https:∥woodyoilplants.iflora.cn/)，對這些PIN基因的表達模式進行了分析。結(jié)果顯示，RcPIN1-1和RcPIN1-2基因在胚和根中的表達水平較高，而且RcPIN1-1基因在胚中的表達水平明顯強于其它組織(圖6)，暗示其在胚發(fā)育中有重要的功能。RcPIN2基因在根中特異表達。RcPIN3基因在所有檢測的組織中均有表達，且在幼苗、莖、葉片和幼嫩的種子中表達水平較高。RcPIN5基因主要在葉、根和莖中表達，而且在葉片中表達水平明顯強于其它組織。在該數(shù)據(jù)庫中未檢索到RcPIN6基因的表達。而相對于其它的蓖麻PIN基因，RcPIN8在所有組織中的表達均較弱(圖6)。

注：比例尺表示標(biāo)準(zhǔn)化后的相對表達水平，無色框表示較低的表達水平，有色框表示基因的轉(zhuǎn)錄水平較高；種子1-5表示種子的不同發(fā)育階段(10-50天)。

我們進一步利用RT-PCR對這些RcPIN基因的組織表達水平進行了驗證，實驗結(jié)果與上述數(shù)據(jù)庫的結(jié)果基本吻合(圖7)。RcPIN1-1和RcPIN1-2基因在根、葉、雌花和幼嫩的種子中表達水平較高；RcPIN2基因主要在根中表達；RcPIN3、5、6和8基因在所有檢測的組織均有表達，其中RcPIN5基因的表達水平較低。

圖7 蓖麻PIN基因家族在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平

3 討論與分析

本研究共檢索出7條蓖麻PIN基因序列，根據(jù)其與擬南芥PIN基因序列相似程度分別命名RcPIN1-1、RcPIN1-2、RcPIN2、RcPIN3、RcPIN5、RcPIN6、RcPIN8。這些蛋白均呈堿性，序列長度為356-646個氨基酸殘基，分子量大小為38.89-70.39 ku。其中RcPIN5、RcPIN6和RcPIN8的氨基酸長度小于RcPIN1-1、RcPIN1-2、RcPIN3，符合上述亞族分類規(guī)律。這7種RcPIN蛋白均為穩(wěn)定蛋白，但RcPIN2和RcPIN3不穩(wěn)定系數(shù)接近40，無法確切判斷。除RcPIN5和RcPIN8蛋白為疏水性蛋白外，其余RcPIN蛋白均為兩性蛋白。另外，RcPIN5、RcPIN6和RcPIN8有相比于其他蛋白更高的脂溶指數(shù)。研究認(rèn)為，脂溶指數(shù)更高說明PIN5、PIN6和PIN8所在亞族的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性更高[8]。推測這兩個特性與其親水環(huán)長度較小有關(guān)。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，蓖麻PIN蛋白與擬南芥PIN蛋白一樣都為非分泌性蛋白。從二級結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域分析來看，與其他蛋白相比，RcPIN5和RcPIN8的二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)成不同，且跨膜結(jié)構(gòu)域的親水環(huán)結(jié)構(gòu)較不明顯，由于其氨基酸長度較短，這可能導(dǎo)致RcPIN5和RcPIN8跨膜結(jié)構(gòu)域模型與其他成員有差別。序列比對結(jié)果表示，PIN蛋白序列兩端的序列較為保守，而中間的親水環(huán)區(qū)域則差異較大。據(jù)此推測，其不同的生物學(xué)功能可能與其親水環(huán)的差異有關(guān)。這些結(jié)果進一步從生物信息學(xué)的角度證明了擬南芥典型PIN的中心胞質(zhì)親水環(huán)(HL結(jié)構(gòu)域)是導(dǎo)致它們功能差異的原因之一[7,39]。系統(tǒng)進化分析顯示，蓖麻和與其同屬大戟科的木薯、橡膠樹和麻風(fēng)樹進化關(guān)系較為密切，與雙子葉模式植物擬南芥和煙草的進化關(guān)系也較為親密，可以參照這些植物PIN蛋白已知的生物學(xué)功能對蓖麻PIN蛋白進行下一步的研究。

我們注意到，蓖麻中似乎缺少與AtPIN4以及AtPIN7類似的蛋白。AtPIN3、AtPIN4和AtPIN7蛋白屬同一亞族，在系統(tǒng)進化樹中可以看到，AtPIN3、AtPIN4和AtPIN7蛋白聚成一個枝，進化關(guān)系十分密切。與蓖麻同屬大戟科的植物同樣缺少PIN3、PIN4和PIN7中的一個或兩個，這些植物的生物信息學(xué)研究亦出現(xiàn)類似的結(jié)果。研究表明，AtPIN3、AtPIN4和AtPIN7的進化關(guān)系親密且生物學(xué)功能較為冗余，原因是擬南芥中的AtPIN1、AtPIN3、AtPIN4和AtPIN7基因來源于進化中最近發(fā)生的一次染色體重復(fù)[7,39,40]。

蓖麻具有適應(yīng)能力強、含油量高和經(jīng)濟效益高等特點，獲取的蓖麻油粘度較高，摩擦系數(shù)較低，適合作為工業(yè)用油。獲得產(chǎn)油率高、生長周期短且可用于大規(guī)模種植的優(yōu)良轉(zhuǎn)基因植株是蓖麻育種的首要目標(biāo)，對蓖麻的市場地位與國家的新能源戰(zhàn)略布局均有較大提升。生長素作為植物中重要的內(nèi)源性激素，對植株的生長發(fā)育影響較大。生長素相關(guān)基因?qū)Ρ吐樯L發(fā)育及抗逆性的研究，可為蓖麻育種提供有益的線索。PIN蛋白是生長素極性運輸?shù)闹饕袚?dān)者，目前對其在擬南芥等植物生長發(fā)育過程中功能的研究已有許多進展。若能以此為依據(jù)，探明蓖麻中PIN蛋白的生物學(xué)功能，則可以為其生長素極性運輸機制的研究奠定基礎(chǔ)，為選育蓖麻新品種和蓖麻種植行業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。