賀海波，朱麗金，賀君宇，江偉杰，王 曉，彭 校，陳燁韜，宋利華，張繼紅，鄒 坤

委陵菜酸對幽門螺桿菌誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

賀海波1，朱麗金1，賀君宇2，江偉杰1，王 曉1，彭 校1，陳燁韜1，宋利華1，張繼紅3*，鄒 坤1

1. 三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥食同源大健康產(chǎn)品開發(fā)利用宜昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002 2. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002 3. 三峽大學(xué)中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院脾胃病科，湖北 宜昌 443002

探索委陵菜酸對幽門螺桿菌（，Hp）誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1損傷的影響。GES-1細(xì)胞與Hp共培養(yǎng)，給予委陵菜酸和NOD樣受體家族3（NOD-like receptor family 3，NLRP3）抑制劑MCC950，考察各組細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放率、集落形成、凋亡率、線粒體膜電位和活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）變化；采用ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、角質(zhì)細(xì)胞趨化因子（keratinocyte chemokines，KC）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin -1β，IL-1β）、IL-6、IL-18、IL-4和IL-10水平；采用試劑盒檢測各組細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；采用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞Toll樣受體4（toll-like receptor 4，）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，）、、、和mRNA表達(dá)情況；采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞TLR4/NLRP3/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和線粒體凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。委陵菜酸顯著抑制Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞LDH釋放率（＜0.05、0.01），促進(jìn)細(xì)胞集落形成（＜0.05、0.01），抑制細(xì)胞凋亡（＜0.05、0.01）；升高細(xì)胞線粒體膜電位（＜0.01），降低ROS水平（＜0.01）；降低上清液中MCP-1、KC、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18水平（＜0.01），升高IL-4和IL-10水平（＜0.01）；升高細(xì)胞GSH-Px、SOD和CAT活性（＜0.01），降低MDA含量（＜0.01）；降低細(xì)胞、、、mRNA表達(dá)水平（＜0.01），升高、mRNA表達(dá)水平和/、/（＜0.01）；下調(diào)細(xì)胞TLR4、MyD88、磷酸化IκB激酶β（phosphorylated inhibitor kappa B kinase β，p-IKKβ）、p-IκBα、NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）、半胱氨酸蛋白酶-1前體（pro-Caspase-1）、Caspase-1、硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）、pro-IL-1β、pro-IL-18、Bax、Bad、細(xì)胞色素C、凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）、剪切型Caspase-9（cleaved Caspase-9）、cleaved Caspase-3和胞核p65蛋白表達(dá)水平（＜0.01），上調(diào)Bcl-2、Bcl-xl、pro-Caspase-9、pro-Caspase-3和胞質(zhì)p65蛋白表達(dá)水平（＜0.01）。委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷具有明顯保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)功能、抑制氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路激活，從而減少線粒體介導(dǎo)的凋亡密切相關(guān)。

委陵菜酸；GES-1細(xì)胞；幽門螺桿菌；炎性反應(yīng)；NLRP3炎癥小體激活；線粒體功能

幽門螺桿菌（Hp）是一種能夠持續(xù)定植在胃內(nèi)并引起胃黏膜炎性反應(yīng)的微需氧革蘭陰性桿菌。目前，世界范圍內(nèi)Hp的人群感染率已超過50%[1]。Hp感染與胃潰瘍、胃炎和胃腺癌等許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，成功根除Hp可有效緩解胃癥狀，并降低潰瘍復(fù)發(fā)率和胃癌發(fā)生率[2]。目前臨床上用于清除Hp感染常用的方法有三聯(lián)療法和四聯(lián)療法，由于其耐藥性和Hp感染流行病學(xué)變化，以及腹瀉和胃腸道異常反應(yīng)等不良反應(yīng)發(fā)生率高、依從性差，長期使用多種抗生素可導(dǎo)致腸道菌群紊亂等諸多不足，導(dǎo)致治愈率大幅降低[3]。

定植于胃黏膜上皮中的Hp釋放毒素相關(guān)基因A（cytotoxin-associated gene A，CagA）、空泡毒素A（Vac lating cytotoxin A，VacA）和尿素酶等毒性因子誘導(dǎo)促炎因子釋放及氧化損傷，而促炎因子通過激活中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）大量產(chǎn)生，促進(jìn)硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）與NOD樣受體家族3（NOD-like receptor family 3，NLRP3）結(jié)合并激活NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）活化，將白細(xì)胞介素-1β前體（interleukin-1β precursor，pro-IL-1β）和pro-IL-18剪切為成熟的IL-1β和IL-18形式，介導(dǎo)炎性反應(yīng)[2]。Huang等[4]發(fā)現(xiàn)IL-1β分泌過多與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，抑制ROS產(chǎn)生和pro-IL-1β、pro-IL-18活化有利于Hp感染和Hp相關(guān)性胃炎的治療。

木瓜為貼梗海棠(Sweet) Nakai的干燥近成熟果實(shí)，性味酸、溫，歸肝、脾經(jīng)，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的功效，用于治療濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛、暑濕吐瀉、轉(zhuǎn)筋攣痛、腳氣水腫等癥[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，木瓜的重要活性成分木瓜三萜對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7及佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠具有較好的抗炎活性，可有效抑制消化道炎性損傷和炎性細(xì)胞浸潤[6-9]。委陵菜酸為木瓜三萜中一種重要的活性成分[8]，可顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-6和IL-8水平，抑制甲基-苯基-吡啶離子（1-methyl-4- phenylpyr-idinium，MPP+）誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y內(nèi)ROS大量生成和細(xì)胞凋亡，與抑制免疫炎性反應(yīng)、炎性因子分泌和調(diào)控線粒體凋亡通路有關(guān)[9-11]。本研究擬在此基礎(chǔ)上，通過Hp誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1損傷，圍繞炎性反應(yīng)、NLRP3炎癥小體激活和線粒體功能來研究委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制，為其臨床治療Hp相關(guān)疾病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

GES-1細(xì)胞由南華大學(xué)顧洪峰教授惠贈(zèng)；Hp NCTC11637菌株由湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原免疫學(xué)教研室伍參榮教授饋贈(zèng)。

1.2 藥品與試劑

委陵菜酸（圖1）由本課題組從長陽土家族自治縣資丘產(chǎn)皺皮木瓜(Sweet) Nakai中分離，并采用紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁共振等波譜學(xué)方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.15%[9]；RPMI 1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清、MTT、Hoechst 33258、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、DCFH-DA探針（批號分別為C22400500BT、D8371、SA190501、T8877、808365、0MYL03、S0033）購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）試劑盒（批號CA1020）購自北京索萊寶科技有限公司；NLRP3抑制劑MCC950（批號5381200001）購自英國Tocris公司；ROS（批號1275755）購自美國Invitrogen公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（批號分別為A045-2、A004、A007-1、A001-1、A005、A003-1、A007-1）購自南京建成生物工程研究所；單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、角質(zhì)細(xì)胞趨化因子（keratinocyte chemokines，KC）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4、IL-10 ELISA試劑盒（批號分別為DKW12-1050-096、DKW12-22310-096、DKW12-2720-096、DKW12- 1060-096、DKW12-2050-096、DKW12-3140-096、DKW12-1080-096、DKW12-2100-096）購自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司；Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）、髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-xl、Bcl-2相關(guān)X蛋白基因（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Bad、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物、Trizol（批號12183555）、DEPC水（批號18080044）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Prime Script TM RT reagent Kit、Taq DNA聚合酶（批號分別為600320、603270）購自寶生物工程（大連）有限公司；IκB激酶β（inhibitor kappa B kinase β，IKKβ）、磷酸化IKKβ（p-IKKβ）、IκBα、p-IκBα、p65、NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）、Caspase-1前體（pro-Caspase-1）、剪切型Caspase-1（cleaved Caspase-1）、TXNIP、Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、細(xì)胞色素C（cytochrome C）、凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）、pro-Caspase-9、cleaved Caspase-9、pro-Caspase-3、cleaved Caspase-3、β-actin抗體（批號分別為sc-1623、sc-0215、sc-7453、sc6721、sc478、sc0321、sc539、sc3291、sc0542、sc0570、sc492、sc356、sc194、sc365、c-sc13560、sc7846、sc7885、sc7654、sc7739、sc7541、sc-1616）購自美國Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的IgG抗體（批號ab73400）購自英國Abcam公司；胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、胞核蛋白提取試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒（批號分別為P0028、P0019、P0215）購自南京碧云天生物技術(shù)有限公司。

圖1 委陵菜酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.3 儀器

ME204E型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；VORTEX-6型高速旋渦混合器（美國奧然公司）；5427R型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；HVA-110型高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）；MCO175型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ECLIPSE TS100TS100-F型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；BX63型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；FACSCanto II型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；M200 PRO型酶聯(lián)免疫檢測儀（瑞士Tecan公司）；NanoDrop One C型微量核酸蛋白濃度測定儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Eco48型qRT-PCR儀（英國Illumina公司）；DYY-16D型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞及細(xì)菌培養(yǎng)

GES-1細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Hp菌株用含10%卵黃和胎牛血清、可溶性淀粉、兩性霉素、磺胺增效劑、萬古霉素的布氏菌選擇性培養(yǎng)基，于37 ℃、10% CO2、5% O2、85% N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞存活率的影響

GES-1細(xì)胞以1×105/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至80%融合。委陵菜酸溶于DMSO配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，以培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過除菌。設(shè)置對照組、模型組和委陵菜酸（1.562 5、3.125 0、6.250 0、12.500 0、25.000 0、50.000 0 μg/mL）組，模型組和各給藥組在感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為100的條件下與Hp共培養(yǎng)2 h，各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對照組和模型組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），于培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝給藥/對照

2.3 委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞LDH釋放率的影響

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞和分組，吸取上清液，按試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞LDH釋放率。

2.4 委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞集落形成的影響

GES-1細(xì)胞以3×102/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至80%融合。設(shè)置對照組、模型組和委陵菜酸（3.125、6.250、12.500 μg/mL）組，模型組和各給藥組在MOI＝100條件下與Hp共培養(yǎng)2 h，各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對照組和模型組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d，每3天更換1次培養(yǎng)基。以PBS沖洗2次，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗2次除去殘留染料后，于顯微鏡下計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算克隆形成率[9]。

克隆形成率＝克隆形成數(shù)/接種數(shù)

2.5 委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡的影響

GES-1細(xì)胞以1×105/孔接種于96孔板，設(shè)置對照組、模型組和委陵菜酸（3.125、6.250、12.500 μg/mL）組，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，以PBS沖洗2次，加入Hoechst 33258染料于37 ℃染色10 min，以PBS沖洗2次去除殘余染料后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.6 委陵菜酸和NLRP3抑制劑MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡的影響

GES-1細(xì)胞以1×105/孔接種于96孔板，設(shè)置對照組、模型組、委陵菜酸（12.5 μg/mL）組和MCC950（8 μmol/L）組，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

2.7 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響

按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，收集細(xì)胞，按試劑盒說明書測定各組細(xì)胞線粒體膜電位[9]。

2.8 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞ROS水平的影響

按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，棄去上清，PBS洗滌1次，加入DCFH-DA探針（10 μmol/L），于培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS洗滌3次，收集細(xì)胞，采用熒光酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.9 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞上清液中MCP-1、KC、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4和IL-10水平的影響

按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，收集上清液，按試劑盒說明書測定各組細(xì)胞上清液中MCP-1、KC、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4和IL-10水平。

2.10 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞GSH-Px、SOD、CAT活性和MDA含量的影響

按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，收集細(xì)胞，超聲破碎后離心，收集上清，按試劑盒說明書測定各組細(xì)胞GSH-Px、SOD、CAT活性和MDA含量。

2.11 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞TLR4、MyD88、Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad mRNA表達(dá)的影響

按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.12 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞TLR4/NLRP3/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和線粒體凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，按照總蛋白、胞質(zhì)和胞核蛋白提取試劑盒說明書分別提取各組細(xì)胞總蛋白、胞質(zhì)和胞核蛋白，經(jīng)核酸測定儀測定蛋白含量后，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉，分別加入TLR4、MyD88、IKKβ、p-IKKβ、IκBα、p-IκBα、p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1、TXNIP、Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、cytochrome C、Apaf-1、pro-Caspase-9、cleaved Caspase-9、pro-Caspase-3、cleaved Caspase-3和β-actin抗體，孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的IgG抗體孵育，加入ECL發(fā)光液顯影[9,12]。

2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，委陵菜酸（3.125 0、6.250 0、12.500 0、25.000 0、50.000 0 μg/mL）組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.2 委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞LDH釋放率的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞LDH釋放率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，委陵菜酸（3.125 0、6.250 0、12.500 0、25.000 0、50.000 0 μg/mL）組細(xì)胞LDH釋放率顯著降低（＜0.05、0.01），尤其以12.500 0 μg/mL委陵菜酸最為明顯，因此以委陵菜酸的適宜質(zhì)量濃度≤12.5 μg/mL進(jìn)行后續(xù)研究。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下同

圖3 委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞LDH釋放率的影響(, n = 5)

3.3 委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞集落形成的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞克隆形成率明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞克隆形成率顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.4 委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡的影響

如圖5所示，對照組細(xì)胞形態(tài)均一完整，呈現(xiàn)弱藍(lán)色熒光，染色質(zhì)分布均勻；模型組可見較多強(qiáng)藍(lán)色熒光染色細(xì)胞，可觀察到典型的凋亡小體，染色質(zhì)濃縮，核碎裂成大小不等的圓形小體；各給藥組細(xì)胞核的濃縮和碎裂明顯減少，正常形態(tài)的細(xì)胞較多見。與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞凋亡率顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖4 委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞集落形成的影響(, n = 5)

箭頭表示凋亡小體

3.5 委陵菜酸和NLRP3抑制劑MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡的影響

NLRP3炎性小體的活化是Hp感染引起促炎因子產(chǎn)生增加的重要機(jī)制之一，靶向NLRP3炎性小體可能是抗Hp感染和治療Hp相關(guān)胃炎的策略[13]。如圖6所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，委陵菜酸（12.5 μg/mL）組和MCC950（8 μmol/L）組細(xì)胞凋亡率均顯著降低（＜0.01）。

3.6 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞線粒體膜電位和ROS水平的影響

線粒體是細(xì)胞凋亡調(diào)控的中心，線粒體活力減弱引起線粒體膜去極化，線粒體膜電位降低，觸發(fā)線粒體介導(dǎo)的一系列凋亡過程[7]。細(xì)胞內(nèi)ROS大量生成會(huì)導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)過氧化損傷，線粒體膜電位降低[8]。因此，ROS大量生成及由此引起的線粒體膜電位下降是線粒體調(diào)控凋亡過程中最早期的特異性改變。如表2所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低（＜0.01），ROS水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，委陵菜酸（12.5 μg/mL）組和MCC950（8 μmol/L）組細(xì)胞線粒體膜電位顯著升高（＜0.01），ROS水平顯著降低（＜0.01）。表明委陵菜酸可以有效抑制Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞ROS生成及線粒體膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而恢復(fù)線粒體膜正常的電位水平。

圖6 委陵菜酸和NLRP3抑制劑MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡的影響(, n = 5)

表2 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞線粒體膜電位和ROS水平的影響(, n = 5)

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.7 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞上清液中MCP-1、KC、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4和IL-10水平的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞上清液中趨化因子（MCP-1、KC）和促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18）水平顯著升高（＜0.01），抗炎因子（IL-4、IL-10）水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，委陵菜酸（12.5 μg/mL）組和MCC950（8 μmol/L）組細(xì)胞上清液中趨化因子（MCP-1、KC）和促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18）水平顯著降低（＜0.01），抗炎因子（IL-4、IL-10）水平顯著升高（＜0.01）。

3.8 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞GSH-Px、SOD、CAT活性和MDA含量的影響

如表4所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞GSH-Px、SOD和CAT活性明顯降低（＜0.01），MDA含量顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，委陵菜酸（12.5 μg/mL）組和MCC950（8 μmol/L）組細(xì)胞GSH-Px、SOD和CAT活性明顯升高（＜0.01），MDA含量顯著降低（＜0.01）。

表3 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞上清液中MCP-1、KC、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4和IL-10水平的影響(, n = 5)

表4 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞GSH-Px、SOD、CAT活性和MDA含量的影響(, n = 5)

3.9 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞TLR4、MyD88、Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad mRNA表達(dá)的影響

如表5所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞、、、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），、mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，委陵菜酸（12.5 μg/mL）組和MCC950（8 μmol/L）組細(xì)胞、、、mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。

表5 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞TLR4、MyD88、Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad mRNA表達(dá)的影響(, n = 5)

3.10 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7和表6～8所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞TLR4、MyD88、p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和胞核p65蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），胞質(zhì)p65蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，委陵菜酸（12.5 μg/mL）組和MCC950（8 μmol/L）組細(xì)胞TLR4、MyD88、p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和胞核p65蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），胞質(zhì)p65蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。

3.11 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞線粒體凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖8和表9、10所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞Bax、Bad、cytochrome C、Apaf-1、cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），Bcl-2、Bcl-xl、pro-Caspase-9、pro-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，委陵菜酸（12.5 μg/mL）組和MCC950（8 μmol/L）組細(xì)胞Bax、Bad、cytochrome C、Apaf-1、cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），Bcl-2、Bcl-xl、pro-Caspase-9、pro-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。

圖7 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表6 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞TLR4/MyD88通路和IKK復(fù)合物相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

表7 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

表8 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞炎性因子蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

圖8 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞線粒體凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表9 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞Bcl-2家族相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

表10 委陵菜酸和MCC950對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞Caspase家族相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

4 討論

陶弘景《名醫(yī)別錄》記載：“木瓜主濕痹邪氣，霍亂大吐下，轉(zhuǎn)筋不止”，可用于治濕濁中焦之腹痛吐瀉轉(zhuǎn)筋。土家族民間有食用木瓜防治胃腸炎、腰酸腿痛、風(fēng)濕和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎傳統(tǒng)。本課題組根據(jù)古代本草中的敘述及土家族民間用藥習(xí)慣，篩選出了具有良好的胃腸道保護(hù)功效和促進(jìn)受損胃腸道黏膜愈合作用的活性成分木瓜三萜[14]，且證實(shí)其具有良好的抗炎、抗氧化活性[6-7]，同時(shí)還兼有較好的保護(hù)胃腸黏膜、促進(jìn)受損胃腸道修復(fù)作用[8-9,15-18]。委陵菜酸是從木瓜三萜中一種重要成分，具有良好的抗氧化、抗消化道炎性反應(yīng)等活性[9-11]。目前委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷的影響尚不清楚，本研究通過建立Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷模型，探究委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用，在此基礎(chǔ)上探尋其可能的作用機(jī)制。

定植于胃黏膜上皮中的Hp釋放CagA、VacA和尿素酶等毒性因子，它們一方面刺激宿主上皮細(xì)胞中還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶產(chǎn)生內(nèi)源性應(yīng)激因子攻擊胃黏膜上皮細(xì)胞膜，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，脂過氧化產(chǎn)物MDA增加，破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致LDH從細(xì)胞內(nèi)漏出[19-20]；另一方面，這些毒性因子還可以影響宿主上皮細(xì)胞骨架重排，激活NF-κB通路，促進(jìn)趨化因子（MCP-1、KC）和促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表達(dá)和釋放，進(jìn)而引起胃黏膜損傷和胃上皮細(xì)胞凋亡[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組細(xì)胞ROS、MDA水平和LDH釋放率明顯升高，上清液中MCP-1、KC、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18水平顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px活性和上清液中IL-4、IL-10水平顯著降低，表明Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷導(dǎo)致了氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的發(fā)生，委陵菜酸能夠抑制Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。

Hp觸發(fā)的炎性反應(yīng)在Hp相關(guān)胃炎病理進(jìn)程中起著重要作用[22-23]。當(dāng)Hp感染胃上皮細(xì)胞后，釋放的CagA、VacA、尿素酶和ROS等毒性因子被上皮細(xì)胞膜上的模式識別受體TLR4識別，促進(jìn)MyD88募集和TLR4/MyD88復(fù)合體形成，通過信號級聯(lián)，促進(jìn)p65的活化，進(jìn)而啟動(dòng)趨化因子、炎性因子的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)MCP-1、KC、IL-6、TNF-α等分泌及pro-IL-18、pro-IL-1β和NLRP3產(chǎn)生，導(dǎo)致炎性反應(yīng)信號傳遞和級聯(lián)放大，參與Hp感染、胃潰瘍、Hp相關(guān)胃炎等病理過程[22,24]。此外，CagA、VacA、尿素酶和ROS等毒性因子進(jìn)入胃黏膜上皮細(xì)胞后，一方面可促進(jìn)硫氧還蛋白/TXNIP復(fù)合物解離，通過促進(jìn)ASC和pro-Caspase-1募集，完成NLRP3炎癥小體的組裝；另一方面可直接引起溶酶體破裂和/或線粒體損傷，導(dǎo)致組織蛋白酶B和/或線粒體內(nèi)容物（ROS、DNA）釋放，激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)pro-Caspase-1自我剪切和Caspase-1釋放，完成pro-IL-1β、pro-IL-18剪切，使IL-1β、IL-18釋放，繼而刺激上皮細(xì)胞，通過自分泌/旁分泌產(chǎn)生更多的趨化因子和炎性因子，加重Hp感染[24-25]。由此可見，TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥小體通路的激活是導(dǎo)致Hp感染胃黏膜上皮細(xì)胞后產(chǎn)生炎性反應(yīng)的關(guān)鍵所在，靶向此通路可有效遏制Hp感染后胃黏膜損傷的病理進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細(xì)胞p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18、胞核p65蛋白表達(dá)水平顯著升高，委陵菜酸干預(yù)后可有效逆轉(zhuǎn)上述異常改變，表明委陵菜酸可通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路炎性激活，進(jìn)而抑制趨化因子、炎癥因子的生成，從而發(fā)揮對Hp損傷的GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用。由于Hp感染能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促使中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤于胃黏膜，最終導(dǎo)致Hp相關(guān)胃十二指腸疾病的發(fā)生[26]。在眾多細(xì)胞因子中，IL-1β是目前已知的關(guān)鍵因子之一，IL-1β作為強(qiáng)有力的促炎因子，在Hp感染、胃潰瘍、胃黏膜炎性反應(yīng)以及胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用，并且在Hp感染患者中IL-1β的水平與胃癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。IL-1β的產(chǎn)生主要依賴于NLRP3炎性小體的形成及活化，活化后的pro-Caspase-1自身裂解形成有活性的Caspase-1，最終導(dǎo)致IL-1β等炎性因子的產(chǎn)生[27]。因此，NLRP3炎性小體的活化可能是Hp感染引起IL-1β水平增加、胃黏膜損傷、慢性萎縮性胃炎等病理過程以及系列疾病的機(jī)制之一。結(jié)合本研究中NLRP3抑制劑MCC950結(jié)果，發(fā)現(xiàn)委陵菜酸的細(xì)胞保護(hù)作用可能與抑制NLRP3炎癥小體組裝和活化有關(guān)。通過檢測細(xì)胞中活化的Caspase-1和IL-1β、IL-18的水平，證實(shí)了委陵菜酸抑制NLRP3炎癥小體活化的假說。

臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在Hp致胃黏膜病變中，細(xì)胞凋亡引起的胃黏膜上皮細(xì)胞丟失明顯，是Hp感染相關(guān)性胃炎的必然原因[28-29]。在這個(gè)過程中，Bcl-2和Caspase家族起著重要作用，促凋亡蛋白（Bax、Bad）通過破壞線粒體膜的完整性進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起線粒體膜電位降低和線粒體膜內(nèi)外生化變化，使cytochrome C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，促進(jìn)Apaf-1與cytochrome C、Apaf-1和pro-caspase-9組裝成凋亡小體，進(jìn)而激活Caspase-3，觸發(fā)細(xì)胞凋亡；抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl）能夠抑制這一過程[30]。本研究結(jié)果顯示，Hp損傷的GES-1細(xì)胞線粒體膜電位降低，細(xì)胞、mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，、mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，cytochrome C蛋白表達(dá)水平升高；委陵菜酸能夠升高GES-1細(xì)胞線粒體膜電位，上調(diào)細(xì)胞、mRNA和蛋白表達(dá)水平，降低、mRNA和蛋白表達(dá)水平，表明委陵菜酸對Hp致GES-1細(xì)胞受損的線粒體功能具有較好的恢復(fù)作用。

Caspase在細(xì)胞凋亡信號通路的調(diào)控中起著重要作用。正常狀態(tài)下，由cytochrome C、Apaf-1和pro-Caspase-9組成的中間復(fù)合物凋亡小體相對較少；當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激（如ROS、趨化因子、促炎因子等）時(shí)，可導(dǎo)致線粒體功能紊亂，cytochrome C大量生成，并從線粒體進(jìn)入胞質(zhì)，促進(jìn)凋亡小體形成，然后依次將pro-Caspase-9、pro-Caspase-3切割成cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]。因此，Caspase-9和Caspase-3被認(rèn)為是凋亡過程的另一個(gè)主要細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，Hp損傷的GES-1細(xì)胞pro-Caspase-9、pro-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低，Apaf-1、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高；委陵菜酸明顯改善Apaf-1和Caspase家族蛋白表達(dá)水平，提示委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與調(diào)控線粒體介導(dǎo)的凋亡通路有關(guān)。

綜上所述，委陵菜酸對Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)功能、抑制氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路激活，從而減少線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡密切相關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect of tormentic acid oninduced GES-1 cells injury

HE Hai-bo1, ZHU Li-jin1, HEJun-yu2, JIANG Wei-jie1, WANG Xiao1, PENG Xiao1, CHEN Ye-tao1, SONG Li-hua1, ZHANG Ji-hong3, ZOU Kun1

1. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, Yichang Key Laboratory of Development and Utilization of Health Products with Drug and Food Homology, China Three Gorges University, Yichang 443002, China 2. Medical College of China Three Gorges University, Yichang 443002, China 3. Department of Spleen and Stomach, Chinese Medicine Clinical Medical College, China Three Gorges University, Yichang 443002, China

To explore the effect of tormentic acid on(Hp)-induced human gastric mucosal epithelial cells GES-1 injury.GES-1 cells were co-cultured with Hp, and then given tormentic acid and NOD-like receptor family 3 (NLRP3) inhibitor MCC950. Cell survival rate, lactate dehydrogenase (LDH) release rate, colony formation, apoptosis rate, mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS) were investigated; Levels of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), keratinocyte chemokines (KC), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), IL-6, IL-18, IL-4 and IL-10 in supernatant of GES-1 cells were detected by ELISA; Glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) activities and malondialdehyde (MDA) levels were detected by kits; mRNA expressions of toll-like receptor 4 (), myeloid differentiation factor 88 (),,,andwere detected by qRT-PCR; The related protein expressions of TLR4/NLRP3/nuclear factor-κB (NF-κB) and mitochondrial apoptosis signal pathways were detected by Western blotting.Tormentic acid significantly inhibited the release rate of LDH induced by Hp (< 0.05, 0.01), promoted cells colony formation (< 0.05, 0.01), inhibited cell apoptosis (< 0.05, 0.01), increased mitochondrial membrane potential (< 0.01), decreased ROS level (< 0.01), reduced levels of MCP-1, KC, TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-18 in supernatant (< 0.01), increased levels of IL-4 and IL-10 in supernatant (< 0.01). Tormentic acid significantly increased activities of GSH-Px, SOD and CAT (< 0.01), reduced MDA level (< 0.01). Tormentic acid significantly reduced,,andmRNA expressions (< 0.01), increased,mRNA expressions and/,/(< 0.01). Tormentic acid significantly down-regulated TLR4, MyD88, phosphorylated IκB kinase β (p-IKKβ), p-IκBα, NLRP3, apoptosis-associated speck-like protein (ASC), pro-Caspase-1, Caspase-1, thioredoxin-interacting protein (TXNIP), pro-IL-1β, pro-IL-18, Bax, Bad, cytochrome C, apoptotic protein activating factor-1 (Apaf-1), cleaved Caspase-9, cleaved Caspase-3 and nuclear p65 protein expressions (< 0.01), and up-regulated Bcl-2, Bcl-xl, pro-Caspase-9, pro-Caspase-3 and cytoplasmic p65 protein expressions (< 0.01).Tormentic acid has a notable protective effect on Hp-injured GES-1 cells, and its mechanism might be closely related to enhancing the function of endogenous antioxidant system, inhibiting the oxidative stress, inflammatory response, and inflammatory activation of TLR4/NF-κB/NLRP3 inflammasome signaling pathway, thereby reducing mitochondrial mediated apoptosis.

tormentic acid; GES-1 cells;; inflammatory response; NLRP3 inflammasome activation; mitochondrial function

R285.5

A

0253 - 2670(2021)16 - 4892 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.014

2021-02-18

湖北省生物酵素工程研究技術(shù)研究中心項(xiàng)目（JS2018-06）；宜昌市科學(xué)技術(shù)局資助項(xiàng)目（A18-302-a2，A21-2-044）；三峽大學(xué)碩士學(xué)位論文培優(yōu)基金資助項(xiàng)目（2020SSPY114，2019SSPY159，2018SSPY140，2017YPY086）

賀海波（1972—），男，博士，副教授，從事中藥藥理學(xué)研究。E-mail: hjy219@126.com

張繼紅（1967—），主任醫(yī)師，從事消化系統(tǒng)基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail: 13872605766@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]