雷飛斌, 汪漢成, 代園鳳, 張傳清*,

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 311300；2. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550081；3. 貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700)

貴州屬于優(yōu)質(zhì)煙草種植區(qū)，常年種植煙草13萬(wàn)公頃左右，是中國(guó)煙葉產(chǎn)量第二大省份。煙草赤星病 (brown spot) 是危害煙草葉部最嚴(yán)重的病害之一，在世界各產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1]。赤星病的病原菌為鏈格孢屬真菌，地區(qū)間有一定差異。據(jù)報(bào)道，云南的煙草赤星病病原菌為交鏈格孢Alternaria alternata和長(zhǎng)柄鏈格孢A. longipes，而河南的為鏈格孢A. alternata、長(zhǎng)柄鏈格孢A. longipes和鴨梨鏈格孢A. yaliinficiens[2]。

目前，生產(chǎn)上煙草赤星病以化學(xué)防治為主，其中苯并咪唑類殺菌劑和二甲酰亞胺類殺菌劑被廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致貴州等地已有關(guān)于鏈格孢A.alternata出現(xiàn)抗藥性情況的報(bào)道[3-4]，急需引入新型藥劑用于其抗性治理和病害防治。以啶酰菌胺(boscalid) 為代表的琥珀酸脫氫酶抑制劑 (SDHIs)對(duì)鏈格孢屬和葡萄孢屬真菌具有較高的生物活性，近年來(lái)已被廣泛用于由多種鏈格孢菌引起的植物病害的防治[5-6]。鑒于此，本研究對(duì)貴州省煙草赤星病病原菌進(jìn)行了分離，綜合形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定結(jié)果對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，同時(shí)建立了貴州省煙草赤星病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感性基線，以期為啶酰菌胺在煙草赤星病防治上的推廣應(yīng)用及后續(xù)監(jiān)測(cè)其敏感性變化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

95%啶酰菌胺 (boscalid) 原藥，浙江新農(nóng)化工股份有限公司提供，用丙酮配制成40 mg/mL的母液，4 ℃下保存。

1.2 菌株的采集與分離

于2014—2015年從貴州省福泉和興義等地田間隨機(jī)采集煙草赤星病病樣，每個(gè)采樣點(diǎn)在采樣前均未曾使用過(guò)SDHIs類殺菌劑。通過(guò)常規(guī)組織分離，每個(gè)采樣點(diǎn)保留5株左右病菌，共分離得到151個(gè)菌株。經(jīng)單孢分離純化后，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA) 斜面平板中于4 ℃保存。其中FQ-1～FQ-64和XY-1～XY-87分別指采自福泉和興義的煙草赤星病菌菌株。

1.3 致病性測(cè)定

將煙草赤星病菌各菌株于25 ℃的PDA平板上培養(yǎng)6 d后，在菌落同一圓周上制取菌餅 (直徑0.5 cm)，(刺傷) 接種于煙草葉片上。在人工氣候箱中于25 ℃、12 h : 12 h (L : D) 條件下保濕培養(yǎng)10 d后觀察發(fā)病情況，以接種無(wú)菌的瓊脂塊為對(duì)照，具有致病性的菌株才用于后續(xù)的鑒定與敏感性研究。

1.4 菌株的鑒定

基于形態(tài)特征和分子鑒定綜合進(jìn)行煙草赤星病菌的鑒定[4]。各供試菌株活化后轉(zhuǎn)移至PDA平板上，于25 ℃ 黑暗培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)，并洗下分生孢子觀察孢子形態(tài)。分子生物學(xué)鑒定時(shí)，采用上海生工生物公司的DNA快速提取試劑盒提取各菌株的基因組DNA。通過(guò)上游引物ITS1(GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC)和下游引物ITS4 (GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC)[7]擴(kuò)增ITS序列，PCR反應(yīng)采用50 μL體系，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ × 5 min，94 ℃ × 30 s，55 ℃ × 45 s，72 ℃ ×1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，送上海生工生物有限公司測(cè)序。

1.5 對(duì)啶酰菌胺敏感性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[3]測(cè)定。在滅菌的PDA培養(yǎng)基中加入啶酰菌胺藥液，啶酰菌胺的質(zhì)量濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 μg/mL。對(duì)于EC50值高于3.2 μg/mL的菌株，增設(shè)6.4 μg/mL的啶酰菌胺處理。將各菌株在PDA平板上預(yù)培養(yǎng)5 d后，從同一菌落外圍制取直徑為0.5 cm的菌餅，轉(zhuǎn)接至上述含不同質(zhì)量濃度啶酰菌胺的PDA平板中央，以不含藥劑但含相同質(zhì)量濃度的丙酮為對(duì)照 (0 μg/mL)。每處理重復(fù)3次。于25 ℃下黑暗培養(yǎng)6 d后測(cè)量各處理的菌落直徑 (cm)，按 (1) 式計(jì)算菌落增長(zhǎng)抑制率 (I)。

(1)式中：Dck為對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑，mm；Dt為處理菌落增長(zhǎng)直徑，mm。利用SPSS軟件，通過(guò)藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值 (x) 與抑制率幾率值 (y)之間的線性回歸關(guān)系，求出毒力回歸方程、EC50值及相關(guān)系數(shù)。

1.6 Sdh B基因序列分析

選擇對(duì)啶酰菌胺敏感性最低 (EC50值最高) 的3個(gè)菌株并隨機(jī)選取其他11個(gè)對(duì)啶酰菌胺敏感的菌株，對(duì)Sdh B基因序列進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物為Sdh BSen-F (GTC CAA GGA AGA CCG CAA GA)；下游引物為Sdh BSen-R (TGA GCA GTT GAG AAT GGT ATG)[8]。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ ×5 min，94 ℃ × 30 s，58 ℃ × 30 s，72 ℃ × 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草赤星病菌菌株的形態(tài)和致病性

分離獲得的不同煙草赤星病菌菌株經(jīng)接種后對(duì)煙草葉片均有致病性，表現(xiàn)為形成圓形或斑駁狀暈圈，干燥后病斑顏色轉(zhuǎn)為棕褐色，但各菌株間的致病性存在顯著差異。菌株間的菌落形態(tài)和孢子形態(tài)有較大差異 (圖1)。菌落大多為圓形，少數(shù)為不規(guī)則圓形；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落會(huì)由白色向灰色、褐色或墨綠至黑色轉(zhuǎn)變，并伴隨有黃褐色或黑色色素沉積。分生孢子在分生孢子梗上成串生長(zhǎng)，形成倒立的棒槌狀分生孢子鏈。分生孢子多胞，呈褐色或黑褐色，有縱、橫隔膜，其中橫隔1～8個(gè)，縱隔0～3個(gè)。所有菌株的ITS與交鏈格孢Alternaria alternata(Fr.)Keissl. 的ITS(KP694828.1) 的同源性均在99%以上。綜合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果，表明貴州省煙草赤星病菌為交鏈格孢A. alternata。

2.2 煙草赤星病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感性基線

采自貴州的102株煙草赤星病菌群體對(duì)啶酰菌胺的EC50值在0.186～5.818 μg/mL之間，平均EC50值為 (2.157 ± 1.112) μg/mL，其中有3株的EC50值大于5 μg/mL。以供試的102個(gè)菌株的EC50值為依據(jù)，從0 μg/mL開(kāi)始，以0.5為組距，將赤星病菌群體 (n= 102) 的EC50值劃分成12個(gè)區(qū)間，統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)間內(nèi)的菌株頻率，以區(qū)間值為橫坐標(biāo)，頻率為縱坐標(biāo)，獲得啶酰菌胺對(duì)煙草赤星病菌各菌株EC50值的頻率分布圖，如圖2所示為連續(xù)分布的單峰曲線，因此認(rèn)為上述平均EC50值 (2.157 ± 1.112) μg/mL可以作為煙草赤星病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感性基線。

2.3 Sdh B基因序列

在所測(cè)定的11株啶酰菌胺敏感菌株和3株對(duì)啶酰菌胺敏感性最低的菌株中，其Sdh B基因第209位和第277位均出現(xiàn)無(wú)意義替換，密碼子分別為GAC和CAT；FQ-39、XY-52和XY-61菌株第224位密碼子發(fā)生替換，其中FQ-39和XY-52由TGC替換為CGC，導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生C224R突變；XY-61菌株替換為GGC，導(dǎo)致發(fā)生C224G突變；FQ-17菌株第226位密碼子由TCA替換為CCA，導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生S226P突變，但這些突變與煙草赤星病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感性沒(méi)有關(guān)聯(lián) (表1)。

表1 煙草赤星病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感性及Sdh B基因序列比較Table 1 Sensitivity to boscalid and comparison of Sdh B segments

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，由貴州省煙草種植田間分離獲得的煙草赤星病的病原菌均為交鏈格孢A. alternata。已有研究報(bào)道，不同煙區(qū)的煙草赤星病菌不完全相同，如吉林省和黑龍江省的煙草赤星病病原菌有交鏈格孢A. alternata、細(xì)極鏈格孢A. tenuissima、鴨梨鏈格孢A. yaliinficiens和長(zhǎng)柄鏈格孢A.longipes4種[9]，而重慶市的煙草赤星病菌則只有交鏈格孢A. alternata[9]。之前有研究報(bào)道，貴州省煙草赤星病病原菌有交鏈格孢和長(zhǎng)柄鏈格孢兩種，而本研究結(jié)果表明，其只有交鏈格孢菌一種，這可能與采樣地區(qū)不同等有關(guān)。另外，文獻(xiàn)報(bào)道中分離獲得的菌株未經(jīng)過(guò)致病性測(cè)試[10]，而本研究所有菌株均進(jìn)行了致病性測(cè)試。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同菌株的形態(tài)特征和致病性有較大差異，這與前人報(bào)道的交鏈格孢的菌落顏色等形態(tài)變異大，而孢子鏈?zhǔn)侵匾姆诸愐罁?jù)是一致的[11]。由于目前對(duì)A. alternata種的界限尚未明確界定，鏈格孢內(nèi)種的關(guān)系仍存在許多爭(zhēng)議[11]，后續(xù)還有待對(duì)貴州省煙草赤星病菌的多樣性進(jìn)行系統(tǒng)、深入分析。

本研究測(cè)定了貴州省煙草赤星病菌群體 (n=102) 菌絲生長(zhǎng)對(duì)啶酰菌胺的敏感性。結(jié)果表明，啶酰菌胺對(duì)交鏈格孢的EC50值范圍為0.186～5.818 μg/mL，平均EC50值為 (2.157 ± 1.112) μg/mL。前人研究發(fā)現(xiàn)，Sdh B發(fā)生H277Y/R等類型的突變是交鏈格孢和茄鏈格孢對(duì)SDHIs產(chǎn)生抗性的主要機(jī)制[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，啶酰菌胺對(duì)3株赤星病菌的EC50值大于5 μg/mL，于是進(jìn)一步分析了其Sdh B基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第209位、277位和224位等密碼子存在一定的核苷酸多樣性，但這種核苷酸多樣性與赤星病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感性沒(méi)有關(guān)聯(lián)，說(shuō)明其仍然屬于敏感菌株。本研究中，赤星病菌群體的敏感性分布為連續(xù)的單峰曲線，所建立的敏感性基線可用于后續(xù)抗性監(jiān)測(cè)。SDHIs屬于單作用位點(diǎn)?；詺⒕鷦芊乐味喾N病害，病原菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性風(fēng)險(xiǎn)的等級(jí)為中至高等[12-13]。目前植物灰霉病菌已對(duì)其產(chǎn)生低水平抗性[6]，后續(xù)還需要進(jìn)一步開(kāi)展煙草赤星病對(duì)SDHIs的抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，并對(duì)該類藥劑應(yīng)用后的田間抗性發(fā)展進(jìn)行監(jiān)測(cè)。