H2S對(duì)Graves甲亢小鼠甲狀腺功能與甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制*

歐慧婷 汪新宇 余懷新 陳澤龍 李明政

(深圳市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州 深圳 518035)

Graves甲亢(Graves’disease，GD)是一種全身特異性自身免疫疾病，也是甲狀腺功能亢進(jìn)癥的最常見原因，占所有患者的50%～80%[1]。甲亢是由于甲狀腺受刺激后產(chǎn)生過多的甲狀腺激素引起內(nèi)分泌代謝性疾病，臨床主要表現(xiàn)為高代謝癥候群、交感神經(jīng)興奮癥候群及甲狀腺腫大，部分患者伴有突眼或脛前粘液性水腫[2]。目前，GD 甲亢的發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療手段主要包括抗甲狀腺藥物、放射性碘和甲狀腺切除術(shù)，但這3種治療手段均有利有弊。硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后發(fā)現(xiàn)的第三氣體調(diào)節(jié)分子，H2S 在機(jī)體大部分組織均可內(nèi)源性生成，其中以腦、心血管系統(tǒng)、肝臟、腎臟生成最多[3]。近些年來，研究證實(shí)H2S具有很好的抗氧化效應(yīng)，可以有效地保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫介導(dǎo)的損害[4-6]。但關(guān)于H2S在甲狀腺疾病中特別是Graves 甲亢中的研究報(bào)道卻相對(duì)較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Graves甲亢小鼠模型來探討H2S對(duì)Graves甲亢小鼠甲狀腺功能的影響，以及對(duì)H2O2誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6～8 周雌性 BALB/c 小鼠45只，均購(gòu)自深圳大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠飼養(yǎng)于溫度恒定在(20±3)℃，相對(duì)濕度為(40±5)%，每日光照：黑暗時(shí)間=12 h：12 h的飼養(yǎng)箱內(nèi)，飼養(yǎng)環(huán)境符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求，期間小鼠自由飲水?dāng)z食。

1.2 主要試劑 Ad-TSHR289重組腺病毒和空載體病毒由武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)構(gòu)建；NaHS、100 IU/mL青霉素與100 μg/mL 鏈霉素、胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲疏咪唑購(gòu)自德國(guó)默克公司；HE染色、RIPA裂解緩沖液和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物研究所；免疫組織化學(xué)染色試劑購(gòu)自上海太陽(yáng)生物科技公司；抗體NIS、TPO、Tg購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗體PCNA、CyclinD1、GAPDH購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/ PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；血清TRAb、T4 和 TSH ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 GD 動(dòng)物模型的建立 將45只BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、空載體病毒組和重組腺病毒組，每組15只。重組腺病毒組小鼠采用Ad-TSHR289重組腺病毒進(jìn)行脛前肌注射誘導(dǎo)GD小鼠模型，于實(shí)驗(yàn)第0、3、6周進(jìn)行注射，共注射三次。同時(shí)，空載體病毒組小鼠注射空載體病毒，正常對(duì)照組小鼠注射等體積PBS溶液。飼養(yǎng)至第10 周時(shí)采集各組小鼠尾靜脈血，檢測(cè)血清促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)、甲狀腺素(T4)和促甲狀腺激素(TSH)濃度。

將造模階段正常對(duì)照組和空載體病毒組小鼠繼續(xù)保留，將GD造模成功[7]的15只小鼠隨機(jī)分為3組：模型組(GD)、H2S組及甲疏咪唑組，每組5只。H2S組小鼠予以NaHS 溶液(56 μmol/kg/d)腹腔注射，甲疏咪唑組小鼠予以甲疏咪唑溶液腹腔注射(3.9 mg/kg/d)，正常對(duì)照組和空載體病毒組小鼠予以等體積 0.9%Nacl 溶液腹腔注射，共干預(yù) 4 周。4周后，取各組小鼠血清、甲狀腺組織，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合善待動(dòng)物的倫理學(xué)要求。

1.3.2 血清TRAb、T4 和 TSH測(cè)定水平 將采集的靜脈血在室溫下靜置待血液自然凝固分層后，析出少量血清，在離心機(jī)3000 rpm下離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測(cè)定血清樣本中TRAb、T4 和 TSH濃度。

1.3.3 甲狀腺組織病理學(xué)觀察 小鼠取血后處死，迅速解剖小鼠摘取甲狀腺組織，采用4%多聚甲醛固定甲狀腺組織。固定24 h后，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明，浸蠟與包埋，使用切片機(jī)連續(xù)切成厚度為5 μm的切片，進(jìn)行HE染色，石蠟切片脫蠟水化后，用蘇木素染色5 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇溶液中分化5 s，自來水沖洗，0.5%伊紅染色2 min，脫水與透明后，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色 將甲狀腺組織石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，在3% 過氧化氫中處理 30 min，高溫(98 ℃)下加熱5 min，加入山羊血清室溫孵育1 h，加入兔抗PCNA(1∶100)、CyclinD1(1∶250)，4 ℃孵育過夜。PBS 液洗后，加二抗室溫孵育1 h。滴加 DAB 顯色，自來水洗滌，加蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察圖像并拍照，通過ImageJ軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果圖片進(jìn)行分析。

1.3.5 Western blot檢測(cè)NIS、TPO及Tg蛋白表達(dá) 將小鼠甲狀腺組織剪碎，加入RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解，4 ℃下12000 r/min 離心20 min，取上清液，通過BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以50 μg蛋白加樣并通過10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜后，加入稀釋后的兔抗NIS(1: 1000)、TPO(1∶1000)、Tg(1∶1000)抗體，以GAPDH(1∶1000)為內(nèi)參，4 ℃下孵育過夜。次日，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜后，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，使用Image Pro-Plus分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.3.6 甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞分離與培養(yǎng) 將小鼠甲狀腺組織剪碎，D-Hanks 液洗滌后，加入含0.25% 胰蛋白酶、250 U/mL Ⅱ型膠原蛋白酶的消化液在37 ℃ 的水浴箱振蕩消化 60 min，以 1000 rpm離心 10 min，棄上清并加入DMEM培養(yǎng)基洗滌沉淀，將離心沉淀反復(fù)輕柔吹打均勻，培養(yǎng)于含有100 IU/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素、100 mL/L 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，次日換液，去除未貼壁的細(xì)胞，以后2～3 d 更換培養(yǎng)基 1 次，每 5 d 傳代 1 次。通過倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)第10 d時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特異抗原NIS免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。

1.3.7 細(xì)胞分組與處理 將培養(yǎng)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、H2O2組及NaHS+H2O2組，并進(jìn)行不同處理：正常對(duì)照組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞正常培養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理；H2O2組使用H2O2(400 μmol/L)溶液處理甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞24 h; NaHS+H2O2組先用 NaHS (400 μmol/L)預(yù)處理甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞 30 min，再用H2O2(400 μmol/L)溶液處理細(xì)胞24 h。

1.3.8 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，取100 μL接種于96 孔板培養(yǎng)，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照1.3.7進(jìn)行分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)，每孔加10 μL CCK-8溶液，再將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)各組細(xì)胞吸光光度值。

1.3.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞按照1.3.7進(jìn)行分組處理后，離心棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，在細(xì)胞懸浮液加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI混合均勻，室溫避光孵育30 min，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清中TRAb、T4 和 TSH水平比較 與正常對(duì)照組比較，重組腺病毒組小鼠血清中TRAb和T4的水平顯著上升，TSH水平顯著下降(均P<0.05)，而空載體病毒組較正常對(duì)照組血清中TRAb、T4 和 TSH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這提示GD小鼠模型成功構(gòu)建，見表1。

表1 造模第10 周各組小鼠血清中TRAb、T4 和 TSH水平比較

藥物干預(yù)4 周后，檢測(cè)各組小鼠血清中TRAb、T4和TSH水平。與正常對(duì)照組比較，模型組、H2S組和甲疏咪唑組小鼠血清中TRAb和T4的水平顯著上升，TSH水平顯著下降(均P<0.05)；與模型組比較，H2S組和甲疏咪唑組小鼠血清中TRAb和T4的水平顯著下降，TSH水平顯著升高(均P<0.05)；H2S組和甲疏咪唑組血清中TRAb、T4 和 TSH水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 藥物干預(yù)4 周各組小鼠血清中TRAb、T4 和 TSH水平比較

2.2 各組小鼠甲狀腺組織病理學(xué)變化觀察 正常對(duì)照組和空載體病毒組小鼠甲狀腺組織中濾泡呈扁平狀，細(xì)胞排列整齊，濾泡腔光滑，可見紅色、均勻的膠質(zhì)；模型組小鼠甲狀腺組織中濾泡大小不等，濾泡腔不光滑，腔內(nèi)膠質(zhì)明顯減少，并出現(xiàn)破裂的現(xiàn)象；H2S組和甲疏咪唑組小鼠甲狀腺組織較模型組甲狀腺組織細(xì)胞形態(tài)變化得到改善，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)扁平狀，濾泡腔內(nèi)的膠質(zhì)增加，見圖1。

圖1 HE染色觀察各組小鼠甲狀腺組織病理學(xué)變化(400×)

2.3 各組小鼠甲狀腺組織中PCNA與CyclinD1表達(dá)檢測(cè) 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠甲狀腺組織中PCNA與CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)顯著增加(P<0.05)，空載體病毒組較正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，H2S組和甲疏咪唑組小鼠PCNA與CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)顯著減少(P<0.05)，且H2S組和甲疏咪唑組PCNA與CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 免疫組化染色檢測(cè)各組小鼠甲狀腺組織PCNA與CyclinD1表達(dá)(400×)

2.4 各組小鼠甲狀腺組織中NIS、TPO、Tg蛋白表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠甲狀腺組織中NIS、TPO與Tg蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而空載體病毒組較正常對(duì)照組NIS、TPO與Tg蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，H2S組和甲疏咪唑組小鼠甲狀腺組織中NIS、TPO與Tg蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)甲狀腺組織NIS、TPO、Tg蛋白表達(dá)

2.5 光學(xué)顯微鏡觀察甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞 通過顯微鏡觀察從小鼠甲狀腺組織分離培養(yǎng)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞貼壁式生長(zhǎng)，呈梭形、多角形，形態(tài)較為均一。免疫熒光染色結(jié)果顯示，胞質(zhì)中可見較強(qiáng)的NIS熒光染色，見圖4。

圖4 甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞觀察與鑒定

2.6 各組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活力比較 與正常對(duì)照組比較，H2O2組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活性在培養(yǎng)24、48、72h顯著下降(均P<0.05)；在培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)，NaHS+H2O2組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活性較H2O2組細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)，見圖5。

圖5 CCK-8檢測(cè)各組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活力

2.7 各組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡比較 與正常對(duì)照組比較，H2O2組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；NaHS+H2O2組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡率較H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖6。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡

3 討論

近年來，GD發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，由于其具有病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，因此給患者帶來了極大痛苦，并給家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8-9]。在 GD 發(fā)病過程中，免疫系統(tǒng)對(duì)甲狀腺正常組織成分的免疫耐受狀態(tài)被打破，免疫細(xì)胞被甲狀腺組織中的特異性抗原激活，產(chǎn)生抗甲狀腺組織的抗體，如針對(duì)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞 TSH 受體的特異性自身抗體，稱為TRAb[10-11]，TRAb 含量的異常增高是GD 的發(fā)病關(guān)鍵，在發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。此外，T4是甲狀腺分泌的主要激素之一，其分泌量增多也是判斷甲亢發(fā)生的重要指標(biāo)，TSH由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成，是下丘腦-垂體-甲狀腺軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)中的重要環(huán)節(jié)，可調(diào)節(jié)甲狀腺激素的合成、分泌并促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞的生長(zhǎng)[12-13]。研究表明，GD過程中，T4、T3過量分泌通過負(fù)反饋途徑抑制TSH的合成與分泌[14]。本研究中，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)注射Ad-TSHR289重組腺病毒的小鼠血清中TRAb和T4的水平上升，且TSH水平下降，由此說明GD小鼠模型構(gòu)建成功。

H2S是一種重要的氣體信號(hào)分子，與許多生理功能有密切的聯(lián)系，其可以通過影響一系列細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程以調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，具有抗氧化、抗炎癥、降血壓、調(diào)節(jié)神經(jīng)功能以及促血管舒張等作用[15-17]。Chen等[18]發(fā)現(xiàn)在小鼠急性腎損傷后，H2S 能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi) ROS 水平，抑制炎癥因子 TNF-α和 IL-1的產(chǎn)生。Kang等[19]的研究表明，當(dāng)大鼠肝臟缺血再灌注后肝臟組織受到氧化損傷，加入NaHS有效地降低組織內(nèi)炎癥因子 TNF-α和IL-10 分泌水平，同時(shí)抑制凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3 的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過NaHS干預(yù)后小鼠血清中TRAb和T4的水平顯著下降，TSH水平顯著升高，且小鼠甲狀腺組織病變得到明顯改善，組織中細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)，且濾泡腔內(nèi)的膠質(zhì)增加。同時(shí)，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NIS、TPO、Tg蛋白表達(dá)水平下降。甲狀腺功能失調(diào)是由于碘化物處理障礙導(dǎo)致甲狀腺激素的生物合成出現(xiàn)缺陷，繼而導(dǎo)致先天性甲狀腺功能減退，這也是常見的內(nèi)分泌疾病[20]。甲狀腺激素的生物合成需要碘化物的存在，NIS、TPO和Tg是甲狀腺素合成過程中的關(guān)鍵因子，而NIS、TPO及Tg增加是導(dǎo)致GD患者血清甲狀腺素升高的重要原因。

CyclinD1是調(diào)節(jié)G1期細(xì)胞增殖的主要因子，PCNA是一種內(nèi)源性增殖細(xì)胞相關(guān)抗原，PCNA與CyclinD1作為細(xì)胞生長(zhǎng)的正性調(diào)節(jié)因子，PCNA羧基端通過與CyclinD1以及CDK結(jié)合成為具有活性的復(fù)合物，其之間相互協(xié)同對(duì)細(xì)胞由G1期過渡到S期起到了促進(jìn)作用[21-22]。CyclinD1在甲狀腺乳頭癌中表達(dá)增高，且在GD患者和小鼠甲狀腺組織中均發(fā)現(xiàn)PCNA表達(dá)的增加。本研究結(jié)果顯示，在NaHS作用下可抑制GD小鼠甲狀腺組織中PCNA與CyclinD1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。

通過分離小鼠甲狀腺組織中甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)H2S在H2O2誘導(dǎo)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞損傷中的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過NaHS預(yù)處理后再經(jīng)過H2O2作用的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞，在培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)細(xì)胞活性明顯高于H2O2組細(xì)胞活性，同時(shí)抑制了細(xì)胞的凋亡。因此，H2S對(duì)H2O2誘導(dǎo)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞損傷起到了保護(hù)作用。

4 結(jié)論

H2S能夠阻止GD小鼠血清中TRAb、T4水平升高及TSH水平下降，抑制甲狀腺組織中PCNA與CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)下調(diào)NIS、TPO及Tg蛋白表達(dá)，以改善甲狀腺組織病變。此外，H2S對(duì) H2O2誘導(dǎo)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。但因GD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，H2S對(duì)甲狀腺功能與甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的損傷的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。