篩選兩萬(wàn)個(gè)人類基因，耶魯團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)蛋白，采用“洗衣液”原理規(guī)避耐藥性，直接殺滅侵入性細(xì)菌

為什么感冒的時(shí)候，吃了很多藥病情卻不見好轉(zhuǎn)？最主要原因之一，是人們長(zhǎng)期食用抗生素類型的感冒藥，使人體中許多病原體產(chǎn)生抗藥性。在免疫學(xué)中，如何高效的殺死革蘭氏陰性菌、如沙門氏桿菌等具有很強(qiáng)抗藥性的細(xì)菌，是一件令人頭痛的問題。

近日，耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種名為“APOL3（Apolipoprotein L3）”的介導(dǎo)蛋白，該蛋白可以像商場(chǎng)中售賣的“洗手液”去污一樣，簡(jiǎn)單粗暴地將入侵人體內(nèi)的病原微生物殺死，還不會(huì)對(duì)人體自身造成傷害。

該團(tuán)隊(duì)將研究目光聚焦在人體內(nèi)自身的自主免疫系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)中“干擾素刺激蛋白”能夠以簡(jiǎn)單高效的方式，將病原微生物清除。

相關(guān)論文以題為《具有類似洗滌劑的活性人體介導(dǎo)蛋白L可殺死細(xì)胞內(nèi)病原體》，發(fā)表在國(guó)際期刊《科學(xué)》上。

相關(guān)論文

該研究由耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院霍華德休斯醫(yī)學(xué)院博士后瑞安·高德、耶魯大學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究所博士后朱世偉，耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物發(fā)病機(jī)理學(xué)和免疫生物學(xué)副教授約翰·麥克米金主導(dǎo)。

朱世偉

負(fù)染電子顯微鏡顯示APOL3直接破壞細(xì)菌內(nèi)膜

該研究成果揭示了APOL3可以通過其兩親螺旋以及跨膜結(jié)構(gòu)域直接和細(xì)菌內(nèi)膜中的磷脂成分結(jié)合，并形成具有動(dòng)態(tài)屬性的納米磷脂環(huán)，就像“洗手液”去污一樣將細(xì)菌內(nèi)膜磷脂溶解，破壞細(xì)菌內(nèi)膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。

所以，只要APOL3蛋白有機(jī)會(huì)接觸到病原細(xì)菌的內(nèi)膜，就可以用簡(jiǎn)單粗暴的方式將侵入人體的細(xì)菌殺死。

病原細(xì)菌的抗藥性是難以解決的科學(xué)問題之一。該研究一針見血地強(qiáng)調(diào)，人類自身可以進(jìn)化出簡(jiǎn)單高效的自我防衛(wèi)策略APOL3天然“去污劑”。體內(nèi)增強(qiáng)APOL3的表達(dá)水平與體外抗生素結(jié)合使用，對(duì)于治療具有耐藥性病原菌感染具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)2萬(wàn)個(gè)人類基因進(jìn)行篩選，進(jìn)一步闡明APOL3的抗菌機(jī)制

人體細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此自然界中許多病原微生物、細(xì)菌、寄生蟲選擇在細(xì)胞內(nèi)增殖。

過去人們普遍認(rèn)為機(jī)體主要靠免疫細(xì)胞來(lái)清除細(xì)菌感染。然而，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)表明，占機(jī)體絕大多數(shù)的非免疫細(xì)胞也可以通過細(xì)胞自主免疫來(lái)遲滯和清除侵入細(xì)胞內(nèi)的病原體。

Ⅱ型干擾素（IFN-γ）通過上調(diào)大量干擾素刺激基因的表達(dá)，在調(diào)控細(xì)胞自主免疫中扮演了重要角色，但里面有很多基因功能及其抗菌機(jī)制并沒有被揭示。為了找到非免疫細(xì)胞中抵御細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染的關(guān)鍵基因，該團(tuán)隊(duì)采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)2萬(wàn)個(gè)人類基因進(jìn)行了篩選。

CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)APOL3的篩選示意圖

CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)APOL3的篩選示意圖

APOL3可以將細(xì)胞內(nèi)的病毒殺死

APOL3通過更加高效地結(jié)合并溶解細(xì)菌內(nèi)膜的酸性磷脂組分，像“去污劑”一樣簡(jiǎn)單粗暴地將細(xì)菌殺死，這一研究結(jié)論增強(qiáng)了人們對(duì)非經(jīng)典免疫系統(tǒng)的認(rèn)知。

但是，IFN-γ在非免疫細(xì)胞和組織中所賦予的抵抗力至今仍難以捉摸。

首先，由于非免疫細(xì)胞常常被視為與免疫系統(tǒng)無(wú)關(guān)而得不到重視。其次，在上皮細(xì)胞中，IFN-γ信號(hào)介導(dǎo)刺激大量相關(guān)的基因產(chǎn)物表達(dá)，其中很多基因表達(dá)產(chǎn)物的功能及其抗菌機(jī)制并沒有被揭示。因此，IFN-γ在非免疫細(xì)胞和組織介導(dǎo)免疫防御機(jī)制仍難以捉摸。

負(fù)染電子顯微鏡顯，顯示APPOL3和納米磷脂環(huán)的形成

首先，用慢病毒搭載Cas9以及全基因組sgRNA（single guide RNAs）文庫(kù)對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。

其次，使用干擾素激活這些細(xì)胞中ISGs的表達(dá)，并進(jìn)一步用熒光標(biāo)記過的沙門氏菌去感染這些HeLa細(xì)胞。

最后，通過流式細(xì)胞術(shù)分選出沙門氏菌高度增殖的HeLa細(xì)胞群體，并通過高通量測(cè)序鑒別出特異富集在這一細(xì)胞類群中的sgRNA。

該團(tuán)隊(duì)運(yùn)用了全基因組CRISPR/Cas9篩選體外脂質(zhì)體實(shí)驗(yàn)，揭示了非免疫細(xì)胞的全新自我防御機(jī)制。

朱世偉表示，“首先，我們發(fā)現(xiàn)APOL3能夠顯著抑制諸如沙門氏菌在內(nèi)的胞內(nèi)病原菌增殖。其次，我們采用高分辨熒光顯微鏡、負(fù)染電子顯微鏡、冷凍電子顯微鏡以及質(zhì)譜等多種手段進(jìn)一步闡明了APOL3的抗菌機(jī)制?！?/p>

該團(tuán)隊(duì)之所以選擇“沙門氏桿菌”作為研究載體，是因?yàn)樗鼘?duì)于此項(xiàng)研究工作的推動(dòng)有實(shí)質(zhì)性幫助。

第一，沙門氏菌是一種常見的食源性病原微生物，能夠引起食物中毒。中毒情況嚴(yán)重時(shí)，可導(dǎo)致誤食者死亡。闡明沙門氏菌與宿主細(xì)胞的相互作用，有助于我們預(yù)防以及治療其引起的疾病。

第二，沙門氏菌是研究細(xì)胞內(nèi)感染機(jī)制的重要模式生物，科學(xué)界對(duì)沙門氏菌本身的生理特性有著相對(duì)完善的認(rèn)知，也開發(fā)了研究諸如突變菌株、基因表達(dá)菌株等細(xì)菌的多種工具。

結(jié)果顯示：針對(duì)APOL3基因的數(shù)個(gè)sgRNA在其中高度富集，提示敲除APOL3會(huì)引起沙門氏菌在HeLa CCL2細(xì)胞內(nèi)過度增殖。

體內(nèi)“洗手液”APOL3，可以簡(jiǎn)單粗暴的方式將侵入性細(xì)菌殺死

朱世偉表示，“我們這篇研究的亮點(diǎn)之一，是再次提出人體表皮、上皮各種細(xì)胞都具有防疫免疫功能，我們發(fā)現(xiàn)如果Ⅱ型干擾素受到外援細(xì)菌入侵，它的表達(dá)就會(huì)升高，會(huì)自動(dòng)調(diào)動(dòng)人體的一些相關(guān)的基因?！?/p>

該團(tuán)隊(duì)通過活細(xì)胞顯微成像技術(shù)對(duì)APOL3進(jìn)行了跟蹤，發(fā)現(xiàn)APOL3能夠迅速轉(zhuǎn)移至暴露的細(xì)菌中，這是APOL其他蛋白所不具備的特征。超分辨熒光成像顯示當(dāng)APOL3靶向IFG-g激活細(xì)胞內(nèi)的病原體時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)菌內(nèi)膜造成致命的傷害。

譬如，在治療由病原菌感染引起的病患時(shí)，

由于很多病原菌具有抗生素抗藥性，所以抗生素很難將它們徹底殺死。在這種情況下，先對(duì)患者的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控是一種行之有效的辦法。當(dāng)患者的自身免疫能力提高，就能夠有效將這些具有抗藥性的病原體殺死。

然而，APOL3作為一種強(qiáng)效的殺菌武器是受嚴(yán)格調(diào)控的。在靜息狀態(tài)下，APOL3的表達(dá)量非常低。當(dāng)細(xì)菌入侵時(shí)，人體會(huì)分泌出干擾素IFNI-γ作為一種警示信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞大量表達(dá)APOL3以及其他相應(yīng)蛋白。APOL3需要與鳥苷酸結(jié)合蛋白（GBP1，Guanylate-Binding Protein 1）蛋白協(xié)同作用，以發(fā)揮最大功效，從而擊穿細(xì)菌外膜脂多糖，幫助APOL3接觸到細(xì)菌內(nèi)膜直接將侵入人體的細(xì)菌殺死。

進(jìn)一步探索人免疫系統(tǒng)的奧秘，讓患者遠(yuǎn)離抗生素

朱世偉做了一個(gè)形象生動(dòng)的比喻，“APOL3與病原體有點(diǎn)像中國(guó)文化里的‘道和魔此消彼長(zhǎng)，整個(gè)免疫系統(tǒng)又像一個(gè)宇宙，有許多奧秘需要探索，除了洗手液A，可能還有洗手液B或者C，本次研究?jī)H僅是一個(gè)開端，后面還有很多寶藏有待挖掘?！?/p>

就人體細(xì)胞而言，還有其它的IFN-γ信號(hào)介導(dǎo)效應(yīng)蛋白有必要了解，其它的效應(yīng)蛋白也有著類似APOL3的抗菌功能?！拔倚枰謩e從細(xì)胞和分子水平上，解析類似APOL3相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步揭示抗菌機(jī)制?！敝焓纻ケ硎?。

由于病原菌病原體的進(jìn)化速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于抗生素的發(fā)明和新型類抗生素的尋找，當(dāng)患者受到抗藥性病原菌感染之時(shí)，有針對(duì)性地增強(qiáng)患者自身干擾素介導(dǎo)的效應(yīng)蛋白表達(dá)，或許是對(duì)抗抗藥性病原菌感染，挽救患者生命的另一種可行方案。

接下來(lái)，該團(tuán)隊(duì)將研究還有哪些干擾素刺激基因蛋白真正參與了直接殺菌;比如，該團(tuán)隊(duì)目前所關(guān)注的鳥苷酸結(jié)合蛋白，是如何識(shí)別病原微生物外膜并將其破壞掉的;是否可以采用體外重構(gòu)的方式來(lái)模擬多種干擾素介導(dǎo)的效應(yīng)蛋白協(xié)同工作，消滅病原微生物;是否可以利用冷凍電鏡在細(xì)胞和分子水平上揭示這些效應(yīng)蛋白的殺菌機(jī)制。這將是該團(tuán)隊(duì)未來(lái)2年～3年內(nèi)攻克的主要難題。

打破前進(jìn)道路中的“枷鎖”，勇攀科研高峰

據(jù)悉，朱世偉博士期間專注于細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域中鞭毛馬達(dá)組裝與結(jié)構(gòu)的研究，為了獲得原位鞭毛馬達(dá)3D結(jié)構(gòu)信息，朱世偉飄洋過海到耶魯大學(xué)學(xué)習(xí)冷凍電子顯微鏡、冷凍電子斷層掃描以及后期圖像處理技術(shù)。后來(lái)，他發(fā)表了細(xì)菌鞭毛馬達(dá)一系列的原位3D結(jié)構(gòu)（PNAS，114（41），10966-10971）。

“結(jié)合我的細(xì)菌學(xué)背景以及所掌握的冷凍電鏡及后期圖像處理技術(shù)，我選擇了細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)互相交叉的細(xì)胞自主免疫作為主要研究方向。使用冷凍電子斷層掃描技術(shù)和冷凍電鏡單顆粒技術(shù)，分別在細(xì)胞和原子水平上，揭示解析細(xì)胞自主免疫過程中IFN-γ信號(hào)介導(dǎo)的相關(guān)效應(yīng)蛋白抗菌機(jī)制?！敝焓纻ケ硎?。

最近，該團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)了植物可以通過相分離的方式來(lái)增強(qiáng)自主免疫防御。朱世偉利用冷凍電子斷層掃描技術(shù)，第一次在原位上捕捉到相分離的結(jié)構(gòu)，并以此為依據(jù)提出了以相分離為介導(dǎo)的植物自主防御模型（Nature 594（7863），424-429）。真核生物可以采用多種多樣的策略去抵抗病原菌入侵，這一系列研究結(jié)果拓寬了朱世偉對(duì)自主免疫防御的認(rèn)知。

朱世偉表示：“科研之路挑戰(zhàn)在所難免，我們要勇于打破前進(jìn)道路上的枷鎖，永攀科學(xué)高峰，為推動(dòng)該研究領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展提供一份力量?！保ㄕ悦馈渡羁萍肌罚?/p>

（編輯/費(fèi)勒萌）