◆作者：李金敏

◆單位：山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司

禽致病性大腸桿菌是禽類重要的腸外致病菌之一，可以引起禽大腸桿菌病。該病多發(fā)生于冬春季節(jié)及氣溫多變時(shí)期，常與其它呼吸道疾病混合或繼發(fā)感染，引起禽類全身性感染，嚴(yán)重可引起敗血癥導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)慘重的經(jīng)濟(jì)損失（孫暢等，2017；Ugwu 等，2020）。近年由于抗生素的無(wú)節(jié)制使用導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株層出不窮，逐漸削弱了抗生素的治療效果（高海濤等，2017；Robin 等，2020）。而噬菌體作為抗生素的替代品之一，因具有殺菌迅速、特異性強(qiáng)，不影響體系正常菌群平衡等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注（羅巧慧等，2020）。目前關(guān)于噬菌體的研究主要集中在生物學(xué)特性及基因組學(xué)等方面的研究，針對(duì)噬菌體發(fā)酵及后處理工藝的研究極少，以致于噬菌體制劑普遍存在效價(jià)低,貯存穩(wěn)定性差等問(wèn)題，極大程度上限制了噬菌體制劑的規(guī)?；a(chǎn)及推廣應(yīng)用（于浩等，2017；汪祥燕等，2018）。

提升噬菌體制劑效價(jià)可通過(guò)提高發(fā)酵效價(jià)及減少凍干、貯存損失來(lái)解決。提高噬菌體發(fā)酵效價(jià)可通過(guò)優(yōu)化一系列發(fā)酵參數(shù)來(lái)調(diào)控發(fā)酵過(guò)程，進(jìn)而提高噬菌體的發(fā)酵密度。減少凍干貯存損失可通過(guò)優(yōu)化噬菌體凍干保護(hù)劑提高凍干及貯存存活率（Manohar 等，2019；Eva 等，2018）。

本研究所用噬菌體Ecp-2原發(fā)酵效價(jià)為109pfu/mL，使用常規(guī)凍干保護(hù)劑凍干，凍干粉存活率約為30%，且貯存損失嚴(yán)重。因此，本研究在該噬菌體現(xiàn)有發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中宿主菌接種量、發(fā)酵液pH值、通氣量等參數(shù)進(jìn)行調(diào)控以及凍干保護(hù)劑配方的優(yōu)化，以期從技術(shù)層面提高噬菌體發(fā)酵液及凍干粉效價(jià)，降低噬菌體制劑的成本、提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，為噬菌體制劑的規(guī)?；a(chǎn)及后續(xù)推廣應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌毒株

宿主菌株B0080、及相應(yīng)的噬菌體Ecp-2 由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司菌種保藏中心保存。

1.2 主要試劑

TSA、TSB 培養(yǎng)基、葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉、酵母膏、脫脂奶粉、海藻糖、硫代硫酸鈉、谷氨酸鈉。

1.3 主要儀器耗材

FDU-1100 真空冷凍干燥機(jī)（日本東京理化）、HPX-9082 MBE 數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)）、GZX-9140 MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱、TCYQ DHZ-CA 大容量振蕩器（太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），超低溫冰箱，高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙英泰儀器）等。

1.4 噬菌體Ecp-2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.4.1 宿主菌接種量及發(fā)酵時(shí)間的確定

宿主菌初始活菌數(shù)為2.5×109cfu/mL, 分別按照裝液量的1%、5%、10%進(jìn)行接種，噬菌體按照該噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（噬菌體/ 宿主菌=10∶3） 進(jìn)行接種，分別在發(fā)酵1、2、3、4、5、6、7h取樣測(cè)定發(fā)酵液噬菌體效價(jià)。

1.4.2 發(fā)酵液pH 值調(diào)控

通氣量1∶1，宿主菌5%接種量，噬菌體接種量按照最佳感染復(fù)數(shù)接種。發(fā)酵過(guò)程中使用NaOH 溶液使發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液p H 分別維持在5.0、6.0、7.0、8.0，另設(shè)初始pH 為7，后續(xù)自然組作為對(duì)照。分別在發(fā)酵1、2、3、4、5h 取樣測(cè)定發(fā)酵液噬菌體效價(jià)。

1.4.3 通氣量的確定

宿主菌接種量按照裝液量5%、發(fā)酵液pH 為7、罐壓等均保持不變，調(diào)整上罐通氣量分別為1∶0.5、1∶1、1∶2.5，培養(yǎng)4.5h，測(cè)定發(fā)酵液噬菌體效價(jià)。

1.5 噬菌體Ecp-2 凍干保護(hù)劑篩選

1.5.1 凍干保護(hù)劑的篩選

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)中對(duì)其他噬菌體具有較好凍干保護(hù)效果的4 種單因素：脫脂奶粉、海藻糖、硫代硫酸鈉、谷氨酸鈉進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.5.2 凍干存活率測(cè)定

將噬菌體過(guò)濾液分裝于無(wú)菌的10mL 離心管中，每管1mL，按照要求加入相應(yīng)組合的凍干保護(hù)劑。將制備好的噬菌體懸液置于-20℃超低溫冰箱內(nèi)預(yù)凍至完全凍結(jié)，將預(yù)凍樣品迅速轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥處理36～48h，使噬菌體凍干粉含水量2%～3%，測(cè)定凍干后噬菌體效價(jià)。凍干存活率計(jì)算公式為：

存活率（%）= 樣品凍干后效價(jià)/ 凍干前效價(jià)×100

1.6 噬菌體Ecp-2 凍干粉貯存穩(wěn)定性研究

將通過(guò)最佳發(fā)酵及后處理工藝制得的噬菌體Ecp-2 凍干粉以玉米淀粉作為載體稀釋至5 ×109cfu/g。 分別置于25、4、-20℃條件下貯存，每30d 取樣測(cè)定效價(jià)，實(shí)驗(yàn)周期180d。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 接種量及發(fā)酵時(shí)間的確定

在宿主菌添加量一定的前提下，噬菌體按照最佳感染復(fù)數(shù)添加，可獲得最高效價(jià)（Abedon等，2016）。本研究通過(guò)調(diào)整宿主菌的初始接種量來(lái)調(diào)控發(fā)酵效價(jià)，如表2 所示，發(fā)酵至7h 發(fā)酵液效價(jià)最高1.50×1010pfu/mL，最高效價(jià)出現(xiàn)在宿主菌5%接種量、發(fā)酵2h，因此選擇宿主菌5%接種、噬菌體按照最佳感染復(fù)數(shù)進(jìn)行接種，培養(yǎng)2h 為該噬菌體發(fā)酵終點(diǎn)。結(jié)果表明適當(dāng)?shù)奶岣咚拗骶褪删w的整體接種比例有助于提高發(fā)酵效價(jià)，過(guò)量的提高初始接種量對(duì)效價(jià)的提升沒(méi)有正向作用，可能由于微生物密度過(guò)大競(jìng)爭(zhēng)生存空間存在一定關(guān)系。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表2 宿主菌接種量對(duì)噬菌體效價(jià)影響（單位：pfu/mL）

2.1.2 發(fā)酵液pH 確定

如表3 所示，不同pH 條件下進(jìn)行發(fā)酵，最高效價(jià)出現(xiàn)在pH=7.0，發(fā)酵2h，最高效價(jià)達(dá)3.5×1010pfu/mL。發(fā)酵過(guò)程中pH值設(shè)置過(guò)高、過(guò)低、或者不控制pH 值均會(huì)影響噬菌體的增殖，這與Grieco 的研究結(jié)果一致（Grieco 等，2009）。

表3 發(fā)酵pH 對(duì)噬菌體效價(jià)影響（單位：pfu/mL）

2.1.3 通氣量的確定

如表4 所示，不同通氣量條件下進(jìn)行發(fā)酵，最高效價(jià)出現(xiàn)在通氣量1∶2.5，發(fā)酵2h，最高效價(jià)達(dá)5.0×1010pfu/mL。可能與高通氣量加快了宿主菌的繁殖速度有關(guān)。

表4 發(fā)酵通氣量對(duì)噬菌體效價(jià)影響（單位：pfu/mL）

2.2 凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化

采用4 因素3 水平正交試驗(yàn)確定脫脂奶粉、海藻糖、硫代硫酸鈉、谷氨酸鈉的復(fù)合配方。由表中R 值可知四種組分對(duì)該噬菌體凍干存活率的影響順序?yàn)锽>A>C>D。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化后最佳凍干保護(hù)劑配方組成為A2B3C2D2，該配方不在正交試驗(yàn)所設(shè)組方中，因此選定該配方與正交試驗(yàn)中凍干存活率最高組A2B3C3D3再次凍干進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如下表所示。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化后的配方A2B3C2D2對(duì)噬菌體Ecp-2 凍干保護(hù)率為79.20%，略高于配方A2B3C3D3。

表5 正交設(shè)計(jì)凍干保護(hù)劑配方對(duì)噬菌體凍干存活率影響

表6 配方驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 噬菌體Ecp-2 凍干粉貯存穩(wěn)定性

由表7 噬菌體在不同溫度貯存穩(wěn)定性結(jié)果可見(jiàn)，凍干粉在-20℃貯存6 個(gè)月效價(jià)幾乎未發(fā)生變化；在4℃貯存6 個(gè)月噬菌體效價(jià)略有降低，存活率仍在89%以上；在25℃效價(jià)急速下降。以上結(jié)果說(shuō)明噬菌體適合在低溫貯存，且該保護(hù)劑可有效延長(zhǎng)貯存時(shí)間。

表7 凍干粉在不同溫度條件下貯存穩(wěn)定性

3 結(jié)論

3.1 噬菌體發(fā)酵工藝優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)室前期摸索出的噬菌體發(fā)酵工藝及培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上對(duì)該噬菌體發(fā)酵工藝進(jìn)一步優(yōu)化，確定噬菌體Ecp-2 最佳發(fā)酵條件為：宿主菌接種量為種子液濃度2.5×109CFU/mL，按照裝液量5%接種；噬菌體按照最佳感染復(fù)數(shù)（噬菌體/ 宿主菌=10-3）進(jìn)行接種；培養(yǎng)溫度37℃；發(fā)酵液pH 控制在7.0、通氣量1∶2.5，培養(yǎng)2h，發(fā)酵液效價(jià)維持在5.0×1010cfu/mL 左右。

3.2 凍干保護(hù)劑的篩選

通過(guò)正交試驗(yàn)確定該噬菌體最優(yōu)凍干保護(hù)劑配方為：脫脂奶粉15%、海藻糖9%、硫代硫酸鈉5%、谷氨酸鈉3%，采用該保護(hù)劑配方進(jìn)行凍干, 噬菌體存活率達(dá)79.20%， 凍干粉效價(jià)達(dá)2.0×1011pfu/g，該配方可應(yīng)用于噬菌體的規(guī)模化生產(chǎn)。

3.3 噬菌體貯存穩(wěn)定性

噬菌體凍干粉由載體稀釋后在不同溫度條件下存放，在-20℃條件下貯存180d 噬菌體效價(jià)與初始相比未發(fā)生明顯改變；4℃條件下貯存180d 噬菌體存活率89%以上，及由此可說(shuō)明該凍干保護(hù)劑不僅可減少凍干過(guò)程的損失，對(duì)于延長(zhǎng)噬菌體制劑的貨架期也具有顯著效果。

參考文獻(xiàn)：（略）