郝一憲 李土玲 魏慧霞 劉金鵬 郭大東 畢宏生

流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，近視在東亞和東南亞地區(qū)人群中普遍高發(fā)，其中青少年近視患病率為80%～90%，且高度近視患病率較高，為10%～20%，預(yù)計(jì)到2050年，全球近視人口將增加至50億[1-2]。近年來(lái)，調(diào)節(jié)在近視發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越受到人們的重視。有研究表明，持續(xù)近距離工作對(duì)睫狀肌造成的長(zhǎng)期壓力可能會(huì)引起兒童近視眼的發(fā)生[3]。還有研究指出，由于異常自主神經(jīng)輸入導(dǎo)致異常的調(diào)節(jié)反應(yīng)，睫狀肌可能參與了近視的發(fā)生、發(fā)展[4]。因此，作為調(diào)節(jié)反應(yīng)的關(guān)鍵組織之一，睫狀肌在近視的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，但具體機(jī)制尚未完全清楚。作為一種平滑肌，睫狀肌由肌纖維束組成，肌束間結(jié)締組織中可見(jiàn)Ⅲ型膠原[5]，而且，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)以及金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)在睫狀肌組織中均有表達(dá)。上述蛋白成分的變化不僅影響細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的更新和重塑，而且影響睫狀肌的形態(tài)和功能變化。因此，睫狀肌中上述蛋白成分的異常表達(dá)可能與近視的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究旨在探討MMP-3、TIMP-3和III型膠原α1(Col3α1)在透鏡誘導(dǎo)型近視豚鼠睫狀肌中的表達(dá)變化，同時(shí)觀察電針干預(yù)對(duì)其表達(dá)的影響，初步揭示睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表達(dá)變化在近視發(fā)展過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑YZ24帶狀光檢影鏡(蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司)；眼科A型超聲儀(法國(guó) Quantel Medical 公司)；針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，華佗牌)；電子診療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，華佗牌SDZ-Ⅴ型)；熒光顯微鏡(日本尼康)；Light Cycler?480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀 (Roche公司)；Elx800 酶標(biāo)儀(美國(guó) BioTek)；10 g·L-1鹽酸環(huán)噴托酯滴眼液(賽飛杰，美國(guó)艾爾康公司)；4 g·L-1鹽酸奧布卡因(倍諾喜，日本參天制藥株式會(huì)社)；改良組織/細(xì)胞 RNA 快速提取試劑盒(山東思科捷科學(xué)儀器有限公司)；HiScript?ⅡQ RT SuperMix qPCR(+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型，碧云天生物技術(shù)有限公司)；MMP-3 、TIMP-3、Col3α1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組2周齡英國(guó)種三色短毛健康雄性豚鼠90只(丹陽(yáng)市呂城鎮(zhèn)奧臣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng))，體重(110±10)g，入組前對(duì)豚鼠眼部進(jìn)行篩選檢查，排除各種眼部疾患。隨后采用隨機(jī)數(shù)字表法將豚鼠分為正常對(duì)照(NC)組、透鏡誘導(dǎo)型近視(LIM)組以及LIM+電針干預(yù)(LIM+EA)組，每組各30只。各組豚鼠均在飼養(yǎng)1周、2周和4周時(shí)給予相應(yīng)的處理。其中，NC 組豚鼠不作任何干預(yù)，LIM組和LIM+EA組豚鼠右眼均配戴-6.00 D透鏡作為造模眼，左眼不戴鏡作為自身對(duì)照；LIM+EA組豚鼠在戴鏡的同時(shí)給予電針刺激兩側(cè)太陽(yáng)穴與合谷穴，每日上午900～1000電針干預(yù)30 min，波形為連續(xù)波，頻率2 Hz，脈沖長(zhǎng)度0.1 s。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持飼養(yǎng)溫度 20～26 ℃，自然照明環(huán)境下12 h/12 h 晝夜循環(huán)，并供給自由飲食。本研究經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并嚴(yán)格遵守視覺(jué)與眼科動(dòng)物研究協(xié)會(huì)(ARVO)原則。

1.2 方法

1.2.1 各組豚鼠屈光度測(cè)量各組豚鼠于造模后 1周、2周和4周均進(jìn)行屈光參數(shù)(近視屈光度)檢查。檢查前使用鹽酸環(huán)噴托酯滴眼液滴入結(jié)膜囊內(nèi)，共3次，每次 1滴，間隔5 min，滴眼30～45 min后進(jìn)行屈光度檢查，每眼至少測(cè)3次，并取其平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 各組豚鼠眼軸長(zhǎng)度測(cè)量各組豚鼠于造模后1周、2周和4周均應(yīng)用眼科A型超聲儀進(jìn)行眼軸長(zhǎng)度測(cè)量，測(cè)量前用鹽酸奧布卡因滴眼2次，每次1滴。儀器參數(shù)設(shè)置參考Zhou等[6]所述參數(shù):前房傳播速度為1557 m·s-1，晶狀體傳播速度為1723 m·s-1，玻璃體傳播速度為1540 m·s-1。測(cè)量前首先將探頭用酒精棉片擦拭消毒，然后將探頭垂直輕觸于角膜頂點(diǎn)處，連續(xù)測(cè)量10次，剔除偏大偏小誤差值后取平均值，整個(gè)過(guò)程中由同一位可熟練操作的視光師完成。

1.2.3 各組豚鼠行組織病理學(xué)染色觀察睫狀肌形態(tài)各組豚鼠造模后1周、2周和4周分別隨機(jī)取3只豚鼠，100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉處死，摘取每只豚鼠造模眼在無(wú)菌生理鹽水中進(jìn)行簡(jiǎn)單沖洗并剔除眼周組織，立即置于眼球固定液中固定24 h，然后進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察每只豚鼠造模眼睫狀肌的生理形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4 q-PCR檢測(cè)各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA表達(dá)造模后1周、2周和4周，各組隨機(jī)選取3只豚鼠腹腔過(guò)量注射100 g·L-1水合氯醛麻醉處死，迅速摘取造模眼眼球，解剖分離出睫狀肌，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。選用改良組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒提取睫狀肌組織總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用q-PCR檢測(cè)各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA表達(dá)。應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行各基因引物序列的設(shè)計(jì)，其中MMP-3上游引物:5’-CTGGGCCTGGGATTAATGGAGACG-3’，下游引物:5’-CAGCAGGAGAGGCAGGAGGAGGAC-3’，大小為255 bp；TIMP-3上游引物:5’-GCATCCGGCAGAAGGGTGGCTACT-3’，下游引物:5’-AGGGGTCTGTGGCGTTGATGA-3’，大小為84 bp；Col3α1上游引物:5’-GACCCCAAGGCCCCAAAGGAGAT-3’，下游引物:5’-AGGGGCACCAGGATGACCAGACG-3’，大小為272 bp；GAPDH 作為內(nèi)參基因，上游引物:5’-CTGACCTGCCGCCTGGAGAAACC-3’，下游引物:5’-ATGCCAGCCCCAGCGTCAAAAGT-3’，大小為170 bp。采用2-△△Ct方法對(duì)各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表達(dá)造模后1周、2周和4周，各組隨機(jī)選取4只豚鼠并分離其造模眼睫狀肌組織，按質(zhì)量體積比(10 mg100 μL)加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA緩沖裂解液，電動(dòng)勻漿充分研磨，5000 r·min-1離心5 min，取上清進(jìn)行超聲破碎，5000 r·min-1離心5 min后取上清，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)測(cè)定各組豚鼠睫狀肌組織溶液中的總蛋白濃度，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠屈光度和眼軸長(zhǎng)度變化造模后1周、2周和4周，與NC組相比，LIM組豚鼠造模眼與自身對(duì)照眼近視屈光度和眼軸長(zhǎng)度的差值均顯著增加(均為P<0.001)；與LIM組相比，LIM+EA組豚鼠造模眼與自身對(duì)照眼近視屈光度和眼軸長(zhǎng)度的差值均減小(均為P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 造模后1周、2周、4周各組豚鼠屈光度和眼軸長(zhǎng)度比較

2.2 各組豚鼠睫狀肌HE染色結(jié)果各組豚鼠睫狀肌HE染色結(jié)果顯示，NC組豚鼠睫狀肌纖維排列

緊密，均勻有序；LIM組豚鼠睫狀肌纖維排列松散混亂，有機(jī)纖維溶解斷裂；LIM+EA組豚鼠睫狀肌纖維排列較LIM組更為有序，相對(duì)完整。另外，隨著造模時(shí)間推移，LIM組豚鼠睫狀肌纖維排列愈加松散，斷裂溶解更加明顯；LIM+EA組豚鼠睫狀肌纖維排列雖仍然紊亂，但與LIM組相比，睫狀肌纖維排列紊亂情況有明顯改善(見(jiàn)圖1)。

圖1 造模后1周、2周和4周各組豚鼠睫狀肌HE染色結(jié)果

2.3 各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA表達(dá)造模后1周和2周，LIM組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平與 NC組相比均明顯升高(均為P<0.01)，LIM+EA組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平與LIM組相比均降低(均為P<0.05)。造模后4周，LIM組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平與 NC組相比均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，LIM+EA組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平與LIM組相比均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 造模后1周、2周和4周各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

2.4 各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表達(dá)造模后1周和2周，LIM 組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白相對(duì)表達(dá)水平與NC組相比均明顯升高(均為P<0.05)，LIM+EA組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白相對(duì)表達(dá)水平與LIM組相比均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。造模后4周，LIM組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 的蛋白表達(dá)相對(duì)水平與 NC組相比均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，LIM+EA組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表達(dá)水平與LIM組相比均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 造模后1周、2周和4周各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表達(dá)

3 討論

有證據(jù)表明，近視的發(fā)生率與近距離工作和閱讀行為有關(guān)[7]。Vasudevan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，早發(fā)性近視和晚發(fā)性近視比正視眼更容易產(chǎn)生因近距離工作誘發(fā)的短暫性近視，且長(zhǎng)時(shí)間近距離工作可造成睫狀肌的持續(xù)收縮引起調(diào)節(jié)痙攣[9]。此外，近視兒童的睫狀肌體積大于非近視兒童，表明睫狀肌可能參與了屈光不正的發(fā)展[10]。本實(shí)驗(yàn)所使用的透鏡誘導(dǎo)型近視豚鼠不僅可模擬人眼在近距離工作中近視的發(fā)生發(fā)展，為探討近視發(fā)生發(fā)展中睫狀肌ECM中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的異常變化提供良好的模型支撐，而且可為臨床應(yīng)用電針干預(yù)防治近視作用機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

MMP主要參與細(xì)胞增殖、遷移和分化，ECM重塑以及組織浸潤(rùn)和血管形成。TIMP作為一種內(nèi)源性組織抑制劑可以調(diào)節(jié)MMP的表達(dá)，并且MMP/TIMP比值通常決定ECM蛋白降解和組織重塑的程度[11]。組織重塑主要涉及ECM的合成和降解，其中MMP-3可降解ECM的各種蛋白多糖成分以及纖連蛋白、層粘連蛋白和明膠[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3的活性可能主要受TIMP-3高活性的抑制[14]。因此，TIMP-3作為MMP-3的抑制劑，其表達(dá)水平應(yīng)與MMP-3成反比。Col3α1主要參與細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化，且在許多纖維化疾病，如腎纖維化、肝纖維化和系統(tǒng)性硬化癥中，其含量增加，形成更纖細(xì)的原纖維[15]。在本研究中，造模后1周和2周LIM組和LIM+EA組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表達(dá)均上調(diào)，與Jia等[16]研究結(jié)果相一致，即在近視(屈光度<-6.00 D)穩(wěn)定期患者的眼球標(biāo)本房水中MMP-3和TIMP-3水平升高。根據(jù)動(dòng)態(tài)平衡假說(shuō)，TIMP表達(dá)水平的升高反映了一種細(xì)胞代償反應(yīng)，即為抵消和限制因MMP水平升高引起ECM的強(qiáng)烈降解致使TIMP的表達(dá)代償性增加[17]。因此，本研究中TIMP-3表達(dá)量增加可能是對(duì)近視豚鼠睫狀肌異常變化的代償性反應(yīng)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，造模后1周和2周，LIM+EA組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表達(dá)均低于LIM組，提示電針干預(yù)近視豚鼠可影響睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表達(dá)，從而延緩近視的發(fā)生、發(fā)展。上述結(jié)果提示，在近視的發(fā)生發(fā)展中，MMP-3、TIMP-3和Col3α1的異常表達(dá)可能改變了睫狀肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響睫狀肌的生理功能。

纖維化主要表現(xiàn)為損傷部位的成纖維細(xì)胞遷移、增殖以及ECM(包括膠原I、II、III、IV等)的沉積，常見(jiàn)于各種器官，包括心臟、肝、肺和腎臟[18]。纖維化主要包括四個(gè)階段，其中前3個(gè)階段分別為原發(fā)性組織損傷(第一階段)、激活效應(yīng)細(xì)胞(第二階段)和產(chǎn)生ECM (第三階段)，在第四階段中，ECM的動(dòng)態(tài)沉積和清除不充分導(dǎo)致纖維化增加，最終導(dǎo)致器官功能衰竭[19]。在某些病理因素的影響下，眼內(nèi)組織也可發(fā)生纖維化病變，如角膜纖維化、結(jié)膜纖維化、視網(wǎng)膜纖維化和鞏膜纖維化[20-22]。有研究結(jié)果表明，在纖維化動(dòng)物模型中，其建立的纖維化可能會(huì)消退，可能與存在去除ECM沉積的內(nèi)源性機(jī)制有關(guān)[23]。還有研究表明，MMP-3、TIMP-3和Col3α1等細(xì)胞因子參與了肺纖維化及肝纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展[24-26]。在近視的發(fā)展過(guò)程中，ECM的丟失可能導(dǎo)致鞏膜重塑和眼軸增長(zhǎng)[27]。本研究結(jié)果顯示，造模后4周LIM組近視豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均明顯下調(diào)且低于NC組，因此推測(cè)隨著近視度數(shù)的增加，睫狀肌形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生病變，效應(yīng)細(xì)胞活性下降，細(xì)胞合成細(xì)胞因子的功能受阻，相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平相應(yīng)降低，進(jìn)而導(dǎo)致睫狀肌正常的調(diào)節(jié)功能受阻，并逐漸導(dǎo)致睫狀肌功能受到抑制；而造模后4周，LIM+EA組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均高于LIM組，推測(cè)電針干預(yù)可恢復(fù)受損的睫狀肌細(xì)胞的生理功能，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而改善睫狀肌組織的局部微環(huán)境，并影響睫狀肌組織的重塑過(guò)程，從而延緩近視的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，睫狀肌形態(tài)與功能的異常變化可影響近視的發(fā)生、發(fā)展，在近視發(fā)展初期，透鏡誘導(dǎo)型近視豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1表達(dá)水平的上調(diào)可能導(dǎo)致睫狀肌發(fā)生纖維化病變，致使睫狀肌組織發(fā)生不同程度的重塑；電針干預(yù)可使透鏡誘導(dǎo)型近視豚鼠近視屈光度和眼軸長(zhǎng)度增長(zhǎng)減緩，且顯著下調(diào)睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表達(dá)，影響睫狀肌組織的重塑過(guò)程，從而在近視治療中發(fā)揮一定的作用。但電針干預(yù)治療近視的具體作用機(jī)制尚不明了，還需進(jìn)一步研究及探索。