高通量測(cè)序研究濃香型酒醅的細(xì)菌菌群多樣性及共變性

陳慧穎， 李慧星， 許 彬， 曹 斌， 王春艷,3 1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； .南陽(yáng)理工學(xué)院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473004； 3.南陽(yáng)理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473004

白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的蒸餾酒，酒醅中微生物的組成及其變化規(guī)律對(duì)白酒品質(zhì)具有重要影響[1]。酒醅細(xì)菌在白酒生產(chǎn)中起著關(guān)鍵作用，一是參與白酒生產(chǎn)主要代謝途徑；二是增加白酒風(fēng)味；三是豐富白酒活性成分[2,3]。然而與酒曲和窖泥相比，酒醅細(xì)菌菌群的相關(guān)研究仍然較少[3]。

高通量測(cè)序技術(shù)可以快速分析復(fù)雜體系的微生物菌群，且提供全面準(zhǔn)確的菌群信息[4,5]，已被應(yīng)用于不同香型白酒酒醅的細(xì)菌菌群研究[6-12]。ZOU等[6]指出瀘型白酒酒醅中芽孢桿菌屬Bacillus和乳桿菌屬Lactobacillus是優(yōu)勢(shì)菌屬。Jing[7]等基于高通量測(cè)序分析兩個(gè)品牌醬香型酒醅的細(xì)菌多樣性，變形桿菌門Proteobacteria和厚壁菌門Firmicutes的相對(duì)豐度高，乳桿菌屬Lactobacillus和假單胞菌屬Pseudomonas的相當(dāng)豐度隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加。邢敏鈺等[8]采用高通量測(cè)序分析芝麻香型酒醅的乳酸菌菌群，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)屬的乳酸菌，它們分別是魏斯氏菌屬Weissella、片球菌屬Pediococcus、乳桿菌屬Lactobacillus、明串珠菌屬Leuconostoc和乳球菌屬Lactococcus。

濃香型是中國(guó)白酒的重要香型之一，占市場(chǎng)份額70%以上[13,14]。濃香型酒醅的微生物菌群是學(xué)者們的研究熱點(diǎn)[15-29]。SUN等[27]采用高通量測(cè)序分析濃香型酒醅的細(xì)菌多樣性，結(jié)果表明醋桿菌屬Acetobacter和乳桿菌屬Lactobacillus為豐度最高的物種，與冬季酒醅相比，夏季酒醅的乳桿菌屬Lactobacillus豐度增加，醋酸桿菌屬Acetobacter豐度降低。翟磊等[28]采用高通量技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)宜賓產(chǎn)區(qū)濃香型酒醅中細(xì)菌主要以片球菌屬Pediococcus、乳桿菌屬Lactobacillus和瘤胃球菌屬Ruminococcus為主，其中片球菌和乳桿菌為主的乳酸菌是發(fā)酵中后期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。高江婧[25]等研究發(fā)現(xiàn)濃香型酒醅整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳桿菌科Lactobacillaceae和腸桿菌科Enterobacteriaceae的相對(duì)豐度降低，瘤胃菌科Ruminococcaceae和梭菌科Clostridiaceae微生物的相對(duì)豐度增加。胡曉龍[29]等采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了賈湖酒醅微生物群落，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬Lactobacillus是發(fā)酵中、后期酒醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物，同時(shí)間節(jié)點(diǎn)下各層酒醅的微生物聚類沒(méi)有明顯規(guī)律。不同香型白酒酒醅的細(xì)菌菌群有差異性，相同香型不同來(lái)源的白酒酒醅的細(xì)菌菌群同樣存在差異。然而，當(dāng)前研究多集中于某個(gè)酒廠酒醅發(fā)酵過(guò)程的功能細(xì)菌[20-24]、細(xì)菌菌群多樣性及其與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)[25-29]，而對(duì)酒醅細(xì)菌菌群的共性變化規(guī)律研究較少。實(shí)驗(yàn)取樣于河南三個(gè)不同濃香型白酒廠的酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)，采用的Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分別研究入窖酒醅和出窖酒醅的細(xì)菌菌群，依次在門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)和屬(genus)5個(gè)水平上進(jìn)行分析，一方面展示河南濃香型白酒入窖酒醅和出窖酒醅的細(xì)菌微生物多樣性；另一方面，分析三個(gè)不同酒廠的酒醅發(fā)酵后細(xì)菌菌群的共性變化規(guī)律，為深度探究白酒酒醅的細(xì)菌菌群提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

濃香型酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)樣品分別取自于河南南陽(yáng)社旗、濮陽(yáng)南樂(lè)和周口鹿邑的三個(gè)白酒廠[30]，入窖酒醅分別命名為EFG-1，EFG-2，EFG-3；出窖酒醅分別命名為OFG-1，OFG-2，OFG-3。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)分析參考文獻(xiàn)[5]。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物。341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTA CHVGGGTATCTAATCC。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序序列數(shù)目和多樣性指數(shù)分析

濃香型酒醅樣品經(jīng)高通量測(cè)序和質(zhì)量控制后，獲得有效序列。根據(jù)差異水平在0.03(即相似度97%)的水平上聚類得到操作分類單元(OTU)。由表1可以看出：樣品測(cè)序的覆蓋率均大于95%，表明測(cè)序結(jié)果代表樣品的真實(shí)情況。三個(gè)入窖酒醅樣品(EFG-1、EFG-2和EFG-3)的有效序列數(shù)量分別是34 219、45 593和32 362，聚類得到OTU數(shù)目分別為5 681、7 684和4 221；三個(gè)出窖酒醅樣品(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的有效序列數(shù)量分別是31 978、33 265和40 932，聚類得到OTU數(shù)目分別為3 792、3 091和1 811。在序列聚類獲得OTU的基礎(chǔ)上，分別采用Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)描述菌群物種的多樣性，其中Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)越大，說(shuō)明群落多樣性越高。EFG-1、EFG-2和EFG-3的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均大于OFG-1、OFG-2和OFG-3的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)，說(shuō)明入窖酒醅的細(xì)菌菌群多樣性高于出窖酒醅的細(xì)菌菌群多樣性。濃香型酒醅經(jīng)過(guò)發(fā)酵后細(xì)菌菌群的物種多樣性降低。這是由于濃香型酒醅發(fā)酵是在厭氧條件下的產(chǎn)酶、產(chǎn)酸、產(chǎn)酒精等復(fù)雜過(guò)程，入窖酒醅的細(xì)菌微生物在發(fā)酵過(guò)程中不斷衰亡后分解[29]。

表1 OTU數(shù)量及多樣性指數(shù)

實(shí)驗(yàn)依次在門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)和屬(genus)5個(gè)分類水平上進(jìn)行分析，通過(guò)酒醅樣品的細(xì)菌菌群分布和變化趨勢(shì)來(lái)闡釋酒醅中細(xì)菌菌群的多樣性和共變性。為了使細(xì)菌菌群分布的顯示效果較好，實(shí)驗(yàn)選取相對(duì)豐度較大的前15個(gè)物種，將相對(duì)豐度較低的部分合并為Other顯示在圖上。細(xì)菌菌群變化趨勢(shì)是在細(xì)菌菌群分布的基礎(chǔ)上，將三個(gè)入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和三個(gè)出窖酒醅樣品(OFG-1、OFG-2和OFG-3)分別進(jìn)行比較，分析出三個(gè)不同來(lái)源濃香型酒醅發(fā)酵后具有相同和顯著變化趨勢(shì)的細(xì)菌物種。

2.2 在門(Phylum)水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群

圖1為在門(Phylum)水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群，可以看出：入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的優(yōu)勢(shì)菌群均是厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、異常球菌-棲熱菌門Deinococcus-Thermus，它們的相對(duì)豐度分別為8.86%～90.3%、7.38%～63.34%、0.08%～16.2%、2.04%～9.96%和0.13%～4.99%。分別比較入窖酒醅和出窖酒醅的細(xì)菌菌群分布，圖2顯示了出窖酒醅中厚壁菌門Firmicutes的相對(duì)豐度均高于入窖酒醅中厚壁菌門Firmicutes的相對(duì)豐度，而變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria的相對(duì)豐度降低。

圖1 在門水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群

圖2 在門水平上濃香型酒醅中細(xì)菌變化趨勢(shì)

2.3 在綱(Class)水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群

在綱(Class)水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群如圖3所示，入窖酒醅和出窖酒醅的優(yōu)勢(shì)菌群有桿菌綱Bacilli、梭菌綱Clostridia，放線菌綱Actinobacteria、α-變形菌綱Alphaproteobacteria、β-變形菌綱Betaproteobacteria和γ-變形菌綱Gammaproteobacteria，它們的相對(duì)豐度分別是7.48%～69.24%、1.2%～19.89%、0.78%～17.68%、0.12%～29.7%、0.88%～4.71%和0.48%～28.88%。分別比較入窖酒醅和出窖酒醅的細(xì)菌菌群分布，圖4顯示了在綱水平上濃香型酒醅中細(xì)菌的變化趨勢(shì)。酒醅發(fā)酵后，桿菌綱Bacilli、梭菌綱Clostridia的相對(duì)豐度均有增加，而放線菌綱Actinobacteria、α-變形菌綱Alphaproteobacteria和γ-變形菌綱Gammaproteobacteria的相對(duì)豐度明顯降低。

圖3 在綱水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群

2.4 在目(Order)水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群

在目(Order)水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群如圖5所示，入窖酒醅和出窖酒醅的優(yōu)勢(shì)菌群是乳桿菌目Lactobacillales、芽孢桿菌目Bacillales、梭菌目Bacillales、腸桿菌目Enterobacteriales、根瘤菌目Rhizobiales、微球菌目Micrococcales，它們的相對(duì)豐度分別為5.27%～62.24%、1.92%～32.59%、1.19%～19.85%、0.73%～14.78%、0.54%～13.15%和0.18%～17.09%。分別比較入窖酒醅和出窖酒醅的細(xì)菌菌群分布，圖6顯示了在目水平上濃香型酒醅的細(xì)菌變化趨勢(shì)，酒醅發(fā)酵后乳桿菌目Lactobacillales、梭菌目Bacillales的相對(duì)豐度增加，而腸桿菌目Enterobacteriales、根瘤菌目Rhizobiales、微球菌目Mi-crococcales和伯克氏菌目Burkholderiales的相對(duì)豐度降低。

圖5 在目水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群

圖6 在目水平上濃香型酒醅中細(xì)菌變化趨勢(shì)

2.5 在科(Family)水平上分析濃香型酒醅的細(xì)菌菌群

在科(Family)水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群如圖7所示，入窖酒醅和出窖酒醅的優(yōu)勢(shì)菌群是乳桿菌科Lactobacillaceae、芽孢桿菌科Bacillaceae、高溫放線菌科Thermoactinomycetaceae、梭菌科Clostridiaceae、腸桿菌科Enterobacteriaceae和葡萄球菌科Staphylococcaceae，它們的相對(duì)豐度分別為2.62%～76.77%、0.07%～13.77%、0.02%～18.81%、0.31%～15.78%和0.73%～14.78% 和0.01%～8.22%。分別比較入窖酒醅和出窖酒醅的細(xì)菌菌群分布，圖8顯示了在科水平上濃香型酒醅的細(xì)菌變化趨勢(shì)，酒醅發(fā)酵后乳桿菌科Lactobacillaceae、梭菌科Clostridiaceae的相對(duì)豐度增加，而腸桿菌科Enterobacteriaceae、微球菌科Micrococcaceae的相對(duì)豐度降低。

圖7 在科水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群

2.6 在屬(Genus)水平上分析濃香型酒醅的細(xì)菌菌群

在屬(Genus)水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群如圖9所示，入窖酒醅和出窖酒醅的優(yōu)勢(shì)菌有乳桿菌屬Lactobacillus、腸桿菌屬Enterobacter、短波單胞菌屬Brevundimonas、克羅彭施泰特氏菌Kroppenstedtia、節(jié)桿菌屬Arthrobacter、糖多孢菌Saccharopolyspora、葡萄球菌屬Staphylococcus，它們的相對(duì)豐度分別為1.38%～75.99%、0.15%～12.51%、0.11%～2.78%、0.02%～17.02%、0.05%～14.88%、0.03%～8.37%、0.01%～8.21%。分別比較入窖酒醅和出窖酒醅的細(xì)菌菌群分布，圖10顯示了在目水平上濃香型酒醅的細(xì)菌變化趨勢(shì)，酒醅發(fā)酵后乳桿菌屬Lactobacillus的相對(duì)豐度增加，腸桿菌屬Enterobacter、短波單胞菌屬Brevundimonas的相對(duì)豐度降低。

圖9 在屬水平上濃香型酒醅的細(xì)菌菌群

圖10 在屬水平上濃香型酒醅中細(xì)菌變化趨勢(shì)

3 結(jié)論

基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序展示了河南濃香型酒醅的細(xì)菌微生物多樣性，入窖酒醅的細(xì)菌微生物多樣性高于出窖酒醅的細(xì)菌微生物多樣性。入窖酒醅和出窖酒醅的在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌有厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、異常球菌-棲熱菌門Deinococcus-Thermus；在屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌有乳桿菌屬Lactobacillus、腸桿菌屬Enterobacter、短波單胞菌屬Brevundimonas、克羅彭施泰特氏菌屬Kroppenstedtia、節(jié)桿菌屬Arthrobacter、糖多孢菌屬Saccharopolyspora、葡萄球菌屬Staphylococcus。在濃香型酒醅的細(xì)菌微生物多樣分析基礎(chǔ)上，通過(guò)分別比較三個(gè)不同酒廠的入窖酒醅和出窖酒醅的細(xì)菌菌群，可知濃香型酒醅發(fā)酵后細(xì)菌菌群的顯著共性變化規(guī)律(圖11)：厚壁菌門、桿菌綱、乳桿菌目、乳桿菌科、乳桿菌屬的相對(duì)豐度增加；變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科、腸桿菌屬的相對(duì)豐度降低。酒醅的細(xì)菌菌群在門、綱、目、科、屬5個(gè)分類水平上逐次分析，細(xì)菌物種變化規(guī)律無(wú)法完全可循，如根瘤菌目、伯克氏菌目、梭菌科、微球菌科的相對(duì)豐度變化在屬水平上沒(méi)有分析得到對(duì)應(yīng)的細(xì)菌物種，這是由于分類水平越高，種類越多，相對(duì)豐度較低的物種變化趨勢(shì)逐漸不明顯；另一方面，隨著分類水平的提高，樣品中出現(xiàn)了未分類和未定地位的細(xì)菌。

圖11 濃香型酒醅發(fā)酵后細(xì)菌菌群的變化規(guī)律