乳酸菌發(fā)酵胡柚汁對(duì)小鼠肥胖的調(diào)節(jié)作用

顏 旭，王方杰，吳祖芳,*，翁佩芳

（1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

隨著人們飲食觀念的改變和自我保健意識(shí)的增強(qiáng)，通過(guò)飲食調(diào)整促進(jìn)自身健康的觀念逐漸得到認(rèn)同，綠色、天然、營(yíng)養(yǎng)和保健成為人們選擇食品的重要指標(biāo)。益生菌發(fā)酵果蔬汁產(chǎn)品恰好迎合了現(xiàn)代人的需求，顯示出較好的發(fā)展勢(shì)頭[1-2]。經(jīng)過(guò)發(fā)酵，果蔬汁產(chǎn)品被賦予獨(dú)特風(fēng)味，產(chǎn)生了豐富的乳酸、氨基酸和短鏈脂肪酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，賦予果蔬新的營(yíng)養(yǎng)功能[3]。有研究報(bào)道，一種用乳酸菌發(fā)酵的果汁能夠顯著降低大鼠血液中膽固醇含量，可能是其中的乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了一些活性物質(zhì)所致[4]。發(fā)酵果蔬汁還有抗疲勞作用，同時(shí)還可以緩解腹瀉對(duì)小鼠腸道黏膜的損傷，加強(qiáng)小鼠腸道屏障的防御功能[5]。

常山胡柚（Citrus paradisicv.Changshanhuyou）又名胡柚、金柚，是原產(chǎn)浙江省常山縣的地方柑橘品種，是蕓香科柑橘屬的一個(gè)種，為酸橙與柚雜交的地方柑橘品種，僅浙江常山區(qū)目前年產(chǎn)量就達(dá)10萬(wàn)余噸，且種植面積還在不斷擴(kuò)大。胡柚果實(shí)因富含多種生物活性物質(zhì)、具有較高的保健藥用功能而受到廣泛的關(guān)注[6-7]。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，發(fā)酵胡柚汁（fermented Huyou juice，F(xiàn)HJ）的揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類增加[8]；有機(jī)酸含量變化顯著，總酚和總黃酮類化合物含量提高，自由基清除能力提高，顯著改善了胡柚汁的品質(zhì)和抗氧化特性[9]。目前，對(duì)益生菌FHJ的研究更多集中在加工工藝和品質(zhì)方面，對(duì)其功能性的研究則鮮見(jiàn)報(bào)道。

為研究乳酸菌發(fā)酵胡柚汁對(duì)小鼠肥胖的調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)利用C57/BL6J小鼠開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，通過(guò)飼喂高脂飼料誘導(dǎo)產(chǎn)生肥胖癥狀從而建立肥胖小鼠模型，并對(duì)肥胖小鼠進(jìn)行FHJ飲食干預(yù)，通過(guò)考察小鼠的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)和組織中脂肪積累情況，研究乳酸菌FHJ對(duì)肥胖小鼠的降脂作用，為乳酸菌FHJ功能性評(píng)價(jià)和減肥機(jī)制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠（6 周齡，雄性，平均體質(zhì)量（20±2）g）購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCΧK（滬）2017-0005）。

低脂（對(duì)照）飼料（TP23402，脂肪提供10%能量）、高脂飼料（TP23400，脂肪提供60%能量）購(gòu)于南通特洛菲飼料科技有限公司，飼料主要成分見(jiàn)表1。

表1 高脂飼料和低脂飼料熱量及成分Table 1 Calories and ingredients of high-fat and low-fat diets

新鮮胡柚購(gòu)自浙江省常山縣胡柚種植基地；植物乳桿菌L1（Lactobacillus plantarumL1）、發(fā)酵乳桿菌L2（Lactobacillus fermentumL2）由寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅染液、油紅O染液、脂肪固定液 武漢谷歌生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、異丙醇、無(wú)水乙醇、鹽酸、多聚甲醛 國(guó)藥集團(tuán)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AY-120型電子精密天平 日本Shimadzu公司； LDZΧ-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠； HH-4型恒溫水浴鍋 江蘇國(guó)華電器有限公司；Spectramax190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；MΧ-S/MΧ-F型漩渦混合器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司；JJ-12J脫水機(jī)、JB-P5包埋機(jī) 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機(jī) 徠卡（上海）儀器有限公司；KD-P組織攤片機(jī) 金華市科迪儀器設(shè)備有限 公司；DHG-9140A烤箱 上?；厶﹥x器制造有限公司；Cryotome E冰凍切片機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵胡柚汁的制備

將新鮮胡柚進(jìn)行清洗，去除果皮、囊衣和籽等不可食用部分，得到胡柚果肉。將果肉加水榨汁，過(guò)濾去渣后獲得胡柚果汁。加入體系質(zhì)量8%的白砂糖并攪攔均勻，在85 ℃下巴氏滅菌20 min，冷卻至25 ℃。隨后，將胡柚汁按照總體積的3%接種植物乳桿菌L1和發(fā)酵乳桿菌L2混合發(fā)酵劑（質(zhì)量比為1∶1），接種后的果汁在37 ℃下發(fā)酵36 h，然后在4 ℃冰箱中靜態(tài)放置12 h后熟，得到FHJ[9]。在相同條件下不進(jìn)行接種作為對(duì)照，得到未發(fā)酵胡柚汁（non-fermented Huyou juice，NFHJ）。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前測(cè)定果汁中的活菌數(shù)，F(xiàn)HJ中的活菌數(shù)約為 109CFU/mL，而在NFHJ中未發(fā)現(xiàn)活菌。所得樣品置于4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 動(dòng)物飼養(yǎng)條件及實(shí)驗(yàn)分組

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)程序均嚴(yán)格按照中國(guó)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和飼養(yǎng)規(guī)定在寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行（使用許可證號(hào)：SYΧK（浙）2013-0191）。 購(gòu)得的小鼠經(jīng)外包裝滅菌處理立即放入動(dòng)物房SPF級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24 ℃、相對(duì)濕度（50±10）%，光暗循環(huán)周期為12 h。小鼠在實(shí)驗(yàn)期間可以自由獲得食物和水，墊料每3 d更換一次。

小鼠以高脂飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后均分為4 組，每組8 只小鼠：低脂飲食組（LFD組，飼喂低脂飼料， 灌胃10 mL/（kgmb·d）無(wú)菌水）（對(duì)照）、高脂飲食組（HFD組，飼喂高脂飼料，灌胃10 mL/（kgmb·d）無(wú)菌水）、高脂飲食+FHJ組（FHJ組，飼喂高脂飼料，灌胃10 mL/（kgmb·d）FHJ），高脂飲食+NFHJ組（NFHJ組，飼喂高脂飼料，灌胃10 mL/（kgmb·d）NFHJ）。根據(jù)人類肥胖和超重標(biāo)準(zhǔn)，將肥胖度大于10%視為超重，大于20%視為肥胖并認(rèn)為肥胖模型建立成功。肥胖度按公式（1）計(jì)算[10-11]。實(shí)驗(yàn)以第一天灌胃記為第0周，共持續(xù)8 周，每周記錄3 次小鼠的體質(zhì)量和飲食量、飲水量并計(jì)算平均值。

1.3.3 小鼠臟器指標(biāo)分析

第8周末，所有小鼠禁食過(guò)夜，通過(guò)頸椎脫臼處死小鼠，立即收集血液樣本，放入EP管中，4 ℃靜置30 min，再3 500 r/min離心10 min。取上層血清于干凈的離心管中，分裝3 管，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｑ杆俳馄市∈?，?duì)小鼠的肝臟、心臟、腎臟、脾臟、附睪脂肪、腹腔脂肪、腎周脂肪進(jìn)行稱質(zhì)量。按式（2）計(jì)算小鼠的肥胖指數(shù)，即白色脂肪（附睪脂肪、腹腔脂肪、腎周脂肪）質(zhì)量與體質(zhì)量的百分比。按式（3）計(jì)算小鼠各臟器指數(shù)。

稱質(zhì)量后，將新鮮肝臟組織用預(yù)冷PBS沖洗干凈，取肝臟最大面，切成1 cm×1 cm×1.5 cm大小，置于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中用于組織切片分析。剩余肝臟組織用于抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。將脂肪組織用預(yù)冷PBS沖洗干凈，取附睪脂肪置于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中。

1.3.4 血清生化指標(biāo)和肝臟抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C濃度及ALT、AST活力均采用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

取小鼠肝臟組織準(zhǔn)確稱質(zhì)量，放入5 mL的勻漿管中，加入9 倍體積的勻漿介質(zhì)PBS，冰水浴條件下用眼科小剪盡快剪碎組織塊。將上述組織勻漿液2 500 r/min離心10～15 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。小鼠肝臟中MDA含量和SOD、GSH-Px活力均采用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.5 組織切片分析

將新鮮肝臟組織在體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，用OTC包埋劑進(jìn)行包埋?？焖倮鋬龊笄邢陆M織切片（8～10 μm），并用油紅O染色，在光學(xué)顯微鏡下放大200 倍觀察肝臟脂肪變性程度。

附睪脂肪在體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用一系列體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（50%、70%、85%、90%、95%、100%、100%，各1 h）依次脫水，并包埋在石蠟中。切下組織切片（5～6 μm），并用蘇木精-伊紅染色。通過(guò)顯微鏡放大200 倍獲得圖像。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s多重比較檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠飲食量、飲水量、體質(zhì)量和臟器質(zhì)量的變化

由圖1可知，各組小鼠的日均飲食量和飲水量在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)基本穩(wěn)定，在8 周的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)飲食量保持在3.5～6.0 g，LFD組、HFD組、FHJ組和NFHJ組小鼠的飲食量無(wú)明顯差異；LFD組小鼠的飲水量整體高于HFD組，其他組的飲水量無(wú)明顯差異，保持在每天5.0～7.3 mL。結(jié)果證明FHJ和NFHJ的攝入不會(huì)引起小鼠的食欲下降。

圖1 FHJ灌胃期間小鼠日飲食量（A）和飲水量（B）的變化Fig.1 Changes in daily food intake (A) and water intake (B) of mice during administration of FHJ

對(duì)8 周實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠的平均體質(zhì)量進(jìn)行比較。第0周時(shí)，模型小鼠的初始平均體質(zhì)量為20.0 g。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)整體上升趨勢(shì)。C57BL/6J肥胖小鼠模型建立成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)是高脂飲食組平均體質(zhì)量高于對(duì)照組20%。由圖2A可知，經(jīng)過(guò)8 周的高脂飲食誘導(dǎo)，HFD組小鼠平均體質(zhì)量是LFD組小鼠體質(zhì)量的1.28 倍，具有極顯著差異（P＜0.01），證明肥胖模型誘導(dǎo)成功。在FHJ和NFHJ的灌胃干預(yù)下，與HFD組相比，干預(yù)組小鼠的體質(zhì)量呈現(xiàn)不同程度的下降。從第4周起，F(xiàn)HJ組的平均體質(zhì)量顯著低于HFD組（P＜0.05），第7周起具有極顯著差異（P＜0.01）。而NFHJ組小鼠的體質(zhì)量從第7周開(kāi)始顯著低于HFD組（P＜0.05）。

圖2 FHJ灌胃期間小鼠體質(zhì)量變化Fig.2 Changes in body mass of mice during administration of FHJ

由圖2B可知，至第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，HFD組的體質(zhì)量增量最多，為（11.45±0.65）g，與LFD組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。FHJ組的平均體質(zhì)量增量為（6.49±0.32）g，與HFD組體質(zhì)量增量相比極顯著降低 （P＜0.01）。NFHJ組的平均體質(zhì)量增量為 （8.34±0.37）g，與HFD組相比顯著降低（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)HJ、NFHJ顯著緩解了肥胖小鼠的體質(zhì)量增加，且FHJ的效果更好。

如表2所示，灌胃8 周后，HFD組小鼠的肝臟質(zhì)量為（1.12±0.25）g，相比LFD組顯著增大（P＜0.05），F(xiàn)HJ組和NFHJ組小鼠的肝臟質(zhì)量基本恢復(fù)至正常水平，由表3可知，與LFD組相比，其他3 組小鼠各個(gè)臟器指數(shù)均較低，這是因?yàn)镠FD組的脂肪質(zhì)量增量占體質(zhì)量增量的比重更大，從而導(dǎo)致臟器指數(shù)的降低。各組小鼠的臟器脂肪質(zhì)量具有明顯差異，F(xiàn)HJ組和NFHJ組小鼠的附睪脂肪、腹腔脂肪、腎周脂肪質(zhì)量均低于HFD組，經(jīng)胡柚汁干預(yù)后，肥胖小鼠的白色脂肪總質(zhì)量由HFD組的（2.73±0.25）g顯著降低至FHJ組的（1.32±0.13）g （P＜0.05）以及NFHJ組的（2.16±0.12）g （P＜0.05）。由圖3可知，HFD組小鼠的肥胖指數(shù)高達(dá)（8.72±0.26）%，與LFD組相比具有極顯著差異 （P＜0.01），F(xiàn)HJ和NFHJ的攝入顯著降低了小鼠的肥胖指數(shù)（P＜0.05）。因此，F(xiàn)HJ和NFHJ能夠在一定程度上減少肥胖小鼠體內(nèi)脂肪的累積。

表2 不同飲食對(duì)小鼠臟器質(zhì)量的影響Table 2 Effects of different diets on visceral organ masses of mice

表3 不同飲食對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effects of different diets on visceral organ indexes of mice

圖3 不同飲食小鼠的肥胖指數(shù)Fig.3 Obesity indexes of mice consuming different diets

2.2 小鼠血清生化指標(biāo)分析結(jié)果

由表4可知，與LFD組相比，HFD組小鼠的TC、TG和LDL-C濃度顯著升高，HDL-C濃度顯著下降 （P＜0.05），肥胖小鼠出現(xiàn)高血脂癥狀；同時(shí)HFD組小鼠的AST和ALT活力也顯著升高，分別達(dá)到了（185.40±8.19）U/L和（109.50±5.08）U/L，證明長(zhǎng)期高脂膳食對(duì)小鼠肝臟造成了一定的損傷。灌胃FHJ和NFHJ后，F(xiàn)HJ、NFHJ組與HFD組相比較，TC、TG和LDL-C濃度總體顯著降低，HDL-C濃度顯著升高（P＜0.05），其中TG和LDL-C濃度基本恢復(fù)至正常水平；AST和ALT活力也在FHJ和NFHJ的作用下明顯降低，其中FHJ組的這兩項(xiàng)指標(biāo)分別降低至（156.70±8.17）U/L和（67.80±7.71）U/L， NFHJ組這兩項(xiàng)指標(biāo)分別降低至（169.10±9.23）U/L和（78.40±6.71）U/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)HJ和NFHJ的攝入能夠顯著降低肥胖小鼠的血脂水平，在一定程度上減輕長(zhǎng)期高脂飲食造成的肝臟損傷，并且FHJ的效果 優(yōu)于NFHJ。

表4 FHJ和NFHJ灌胃對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of FHJ and NFHJ on serum biochemical parameters in mice

在肥胖狀態(tài)下，宿主會(huì)將體內(nèi)非酯化的脂肪酸釋放到循環(huán)系統(tǒng)中并在體內(nèi)循環(huán)，從而提高TG水平，降低HDL-C水平，使血脂組成向LDL-C轉(zhuǎn)變，增加動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[12]。而補(bǔ)充益生菌或益生元可以改善肥胖或超重人群的脂代謝，尤其能夠顯著降低TC和LDL-C水平[13-14]。這些觀點(diǎn)可解釋含大量活性乳桿菌的FHJ比NFHJ對(duì)血脂水平的調(diào)節(jié)作用更好。脂肪肝的形成與炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，AST和ALT活力在肥胖脂肪肝形成早期會(huì)顯著升高[15-16]。已有研究報(bào)道，某些乳桿菌能夠通過(guò)降低血清中的TG水平和AST、ALT活力顯著抑制小鼠的肥胖發(fā)展和脂質(zhì)沉積[17]。FHJ的干預(yù)有效緩解了HFD小鼠肝臟的損傷，對(duì)脂肪肝及肝臟病變起到了積極的預(yù)防作用。

2.3 小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)分析結(jié)果

由表5可知，與LFD組相比，HFD組小鼠的MDA水平顯著升高，SOD和GSH-Px活力顯著下降（P＜0.05）。而FHJ組和NFHJ組的MDA水平相比HFD組明顯降低，SOD和GSH-Px活力明顯升高，但與LFD組比較也具有一定差異。

表5 FHJ和NFHJ灌胃對(duì)小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of FHJ and NFHJ on liver antioxidant indexes in mice

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其在機(jī)體內(nèi)的含量變化能夠定量反映生物膜的受損程度，并引發(fā)高血糖，研究證實(shí)肥胖患者體內(nèi)MDA水平較高[18]。攝入FHJ和NFHJ均能夠降低小鼠肝臟組織中的MDA水平，可能是因?yàn)楹种泻胸S富的多酚、黃酮類化合物等抗氧化成分，且益生菌的發(fā)酵也增加了這些物質(zhì)在胡柚汁中的含量[19]，這些成分在機(jī)體內(nèi)顯示出抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，從而減輕了氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損傷。SOD能夠作用于自由基，緩解其對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷，抑制脂質(zhì)的過(guò)氧化，而GSH-Px能夠特異性催化還原型谷胱甘肽成為氧化型谷胱甘肽，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[20]。本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)前期測(cè)定了FHJ和NFHJ的體外抗氧化性指標(biāo)，與NFHJ相比，F(xiàn)HJ對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力分別提高了4.3%、15.9%和0.7%以上[9]，F(xiàn)HJ的抗氧化作用可能與肥胖小鼠受損肝臟SOD和GSH-Px活性的恢復(fù)有關(guān)。

2.4 小鼠肝臟組織和脂肪細(xì)胞的切片分析結(jié)果

由圖4A可知，LFD組小鼠的肝臟呈現(xiàn)紅褐色，表面光滑，且肝臟的形態(tài)正常，而HFD組小鼠的肝臟體積偏大，顏色趨于淺紅，顆粒粗糙且有油膩感，肝臟組織彈性較差。FHJ組、NFHJ組小鼠肝臟在色澤、表面光滑度、組織彈性等方面較HFD組具有明顯改善。

圖4 小鼠肝臟組織學(xué)觀察（×200）Fig.4 Histological observation of liver tissue in mice (× 200)

由圖4B可知，LFD組小鼠肝臟組織油紅O染色面積較小，脂滴也很小，肝細(xì)胞形態(tài)正常；而HFD組肝臟組織中出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，脂滴數(shù)目明顯增多且呈堆積狀，融合為大塊的紅色脂滴；相比之下，F(xiàn)HJ組肝臟切片紅色脂滴體積明顯減小，較為稀疏，呈小顆粒狀不均勻分布，與正常肝臟組織的形態(tài)最為接近；NFHJ組肝臟切片中紅色脂滴體積減小，但相對(duì)聚集成小片分布，肝細(xì)胞脂肪輕度變性。

肝臟是機(jī)體內(nèi)脂類代謝的主要器官，攝入脂肪過(guò)多時(shí)，肝細(xì)胞會(huì)大量積累脂肪，甚至可能發(fā)生病變，形成脂肪肝[21-22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HFD組小鼠因持續(xù)攝入高脂飼料造成肝臟細(xì)胞脂質(zhì)沉積嚴(yán)重，發(fā)生病變，而FHJ組和NFHJ組小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積在不同程度上得到了緩解，這一結(jié)果也與表4中AST、ALT的水平變化結(jié)果相一致。有研究證實(shí)，通過(guò)攝入乳桿菌能夠顯著減少HFD小鼠的體質(zhì)量增加和病原菌的數(shù)量，減輕肝臟組織脂肪變性[23]。FHJ能夠明顯地抑制高脂飲食導(dǎo)致的肝臟組織脂質(zhì)積累，降低肝臟脂肪變性程度，防止脂肪肝等肝臟病變的發(fā)生。

為了觀察攝入胡柚汁對(duì)小鼠脂肪組織的影響，取小鼠附睪脂肪組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。由圖5可看出，LFD組正常小鼠的細(xì)胞體積較小，大小均一、飽滿，形態(tài)較為清晰。HFD組小鼠的細(xì)胞體積明顯增大，呈大空泡狀，細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞膜不完全清晰，相交處可見(jiàn)融合現(xiàn)象。胡柚汁的干預(yù)使實(shí)驗(yàn)組小鼠脂肪組織細(xì)胞的體積出現(xiàn)了不同程度的恢復(fù)，F(xiàn)HJ組和NFHJ組細(xì)胞的形態(tài)基本上較規(guī)則且飽滿，細(xì)胞體積減小，在視野范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)目明顯增多，其中FHJ組的細(xì)胞體積更小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，攝入FHJ和NFHJ均能夠抑制肥胖小鼠的脂肪組織脂質(zhì)積累，改善脂肪細(xì)胞肥大，保護(hù)細(xì)胞形態(tài)，且FHJ的作用效果更好。這主要是因?yàn)樾迈r胡柚汁中含有大量的生物活性化合物（主要有黃酮類、多酚類物質(zhì)），這些活性化合物起到了主要的減脂作用。研究發(fā)現(xiàn)，多酚類物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)會(huì)增加環(huán)腺甘酸的量從而刺激脂肪細(xì)胞的脂肪分解作用，加速脂肪細(xì)胞分解及轉(zhuǎn)化，持續(xù)作用能使脂肪形成記憶，能自覺(jué)地抑制多余脂肪再積聚[24]。同時(shí)越來(lái)越多的證據(jù)表明乳酸菌等益生菌在能量平衡調(diào)節(jié)和體質(zhì)量控制方面起到重要作用[25]。益生菌調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的肥胖機(jī)制可能是益生菌可以改善致胖飲食的負(fù)面作用， 主要是通過(guò)與共生細(xì)菌相互作用改變涉及碳水化合物代謝和丁酸合成途徑微生物代謝酶類的表達(dá)[26-27]。而益生菌發(fā)酵使果汁具有更完整的營(yíng)養(yǎng)功能，本團(tuán)隊(duì)前期測(cè)定了發(fā)酵前后胡柚中總酚、總黃酮的含量，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的胡柚中總酚、總黃酮含量顯著增加[9]，這些活性成分保證了發(fā)酵果汁的高抗氧化能力，對(duì)血漿脂質(zhì)代謝和肝臟抗氧化活性能夠產(chǎn)生積極影響[28]。

圖5 小鼠白色脂肪組織觀察結(jié)果（×200）Fig.5 Histological observation of white adipose tissue in mice (× 200)

3 結(jié) 論

乳酸菌FHJ能夠?qū)Ψ逝中∈蟀l(fā)揮降脂作用，對(duì)肥胖癥狀產(chǎn)生積極的預(yù)防和緩解作用。攝入FHJ或NFHJ能夠顯著緩解肥胖小鼠的體質(zhì)量增加，F(xiàn)HJ效果更好。攝入FHJ或NFHJ顯著降低了肥胖小鼠的血清TC、TG和LDL-C濃度，提高了血清HDL-C濃度，可調(diào)節(jié)肥胖小鼠的血脂代謝；顯著降低血清AST和ALT的水平，在一定程度上減輕了高脂飲食造成的肝臟損傷。攝入FHJ或NFHJ能夠改善由肥胖導(dǎo)致的機(jī)體內(nèi)抗氧化水平降低，能顯著降低小鼠肝臟中的MDA水平，增強(qiáng)SOD和GSH-Px活性，有效改善肝臟氧化應(yīng)激，提高肝臟抗氧化水平。FHJ能夠在一定程度上減少脂肪在肝臟和其他組織、器官中的累積，改善肝臟脂肪變性程度和脂肪細(xì)胞肥大，防止脂肪肝等肝臟病變的發(fā)生。綜上，本實(shí)驗(yàn)對(duì)開(kāi)發(fā)果蔬汁乳酸菌發(fā)酵加工具有一定的參考意義和推動(dòng)作用。