高劑量攝入火麻仁肽和火麻仁蛋白對(duì)小鼠腎功能的影響

朱艷，畢園，王雨辰，馬永慶，王憬，薛晨，谷瑞增，魏穎

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

腎臟疾病的發(fā)病與不良的飲食習(xí)慣密切相關(guān)，尤其是某些高蛋白食品的過量攝入，給腎臟的濾過功能造成了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。但是對(duì)于健身愛好者和一些大病初愈的人群而言，為了達(dá)到增長肌肉和體力恢復(fù)的效果，高蛋白飲食必不可少。但是過量的補(bǔ)充蛋白質(zhì)可能會(huì)增加機(jī)體罹患疾病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，是否存在營養(yǎng)價(jià)值高且對(duì)機(jī)體腎功能損傷程度小的蛋白產(chǎn)品還值得我們進(jìn)一步去發(fā)現(xiàn)。

火麻仁是?？浦参锎舐榈姆N子，又稱漢麻、線麻，是我國歷史悠久的藥用和食用物質(zhì)[2]?；鹇槿手袪I養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，蛋白質(zhì)含量高達(dá)35.9%，不含抗?fàn)I養(yǎng)因子[3]，易消化且含有理想的必需氨基酸成分，因此火麻仁蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源[4]。對(duì)火麻仁蛋白進(jìn)行氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，精氨酸和谷氨酰胺含量豐富，其中精氨酸含量高達(dá)12%[5]，此外還含有很高的支鏈氨基酸[6]?；鹇槿实鞍椎奶厥獍被峤M成賦予了它特殊的生理功能。研究表明，火麻仁蛋白具有抗疲勞[7]、提高運(yùn)動(dòng)員的營養(yǎng)指標(biāo)[8]、增強(qiáng)免疫力[9]、抗氧化等生理功能。而火麻仁肽是以火麻仁蛋白為原料，通過酶解制備的生物活性肽，相比于蛋白質(zhì)而言，生物活性肽的吸收能耗低、不易飽和，且轉(zhuǎn)運(yùn)過程中無競爭性和抑制性[10]，因此其營養(yǎng)價(jià)值相比于蛋白質(zhì)明顯提高。

因此，本文以火麻仁蛋白和火麻仁肽為研究原料，以正常小鼠和環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫力低下小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探究高劑量攝入火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)正常小鼠和免疫力低下小鼠腎功能的影響。以期為將來相關(guān)食品和保健品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康雄性6～8周雄性小鼠[許可證：SCXK(京)2016-0006]，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；環(huán)磷酰胺，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；火麻仁蛋白和火麻仁肽，實(shí)驗(yàn)室自制；總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-PX)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、肌酐(creatinine,CRE)檢測試劑盒、尿酸(uric acid,UA)檢測測試盒、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)檢測試劑盒，南京建成生物技術(shù)有限公司；小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白 M(immunoglobulin M，IgM)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，北京百智生物科技有限公司。

Spectra MR多功能酶標(biāo)儀，美國Dynex公司；721型紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；動(dòng)物麻醉機(jī)，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 火麻仁蛋白和火麻仁肽的制備工藝

火麻仁蛋白和火麻仁肽的制備工藝如下：

火麻仁籽→80～100 ℃冷榨→超臨界萃取→火麻仁粕→粉碎、過篩→堿溶酸沉→火麻仁蛋白；

火麻仁蛋白→1∶10調(diào)漿→調(diào)溫度至55 ℃、調(diào)pH=5→1.5%酸性蛋白酶，30 min→1%中性蛋白酶、1%木瓜蛋白酶，3.5 h→滅酶→吸附、過濾、濃縮→冷凍干燥→火麻仁肽

1.2.2 火麻仁蛋白和火麻仁肽的基礎(chǔ)理化性質(zhì)測定

參考GB 5009對(duì)水分[11]、灰分[12]、脂肪[13]、蛋白[14]含量進(jìn)行測定；采用氨基酸分析儀測定火麻仁肽中游離氨基酸含量；采用凝膠色譜法測定火麻仁肽的分子質(zhì)量分布[15]。

1.2.3 動(dòng)物飼養(yǎng)分組與模型建立

36只健康雄性昆明小鼠，體重(40±2) g，飼養(yǎng)于20 ℃、通風(fēng)良好的環(huán)境中。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為空白組(CM)、免疫力低下組(MG)、正常小鼠灌胃高劑量火麻仁蛋白組(CM+Prot)、正常小鼠灌胃高劑量火麻仁肽組(CM+Pept)、免疫力低下小鼠灌胃高劑量火麻仁蛋白組(MG+Prot)、免疫力低下小鼠灌胃火麻仁肽組(MG+Pept)，一共6個(gè)組，每組6只，蛋白和肽均按照10 g/kg體重(每日蛋白攝入量相當(dāng)于運(yùn)動(dòng)員的攝入水平)的劑量進(jìn)行灌胃，每天上午9～10時(shí)進(jìn)行灌胃，持續(xù)30 d，空白組和免疫力低下組用等量的生理鹽水代替，每周進(jìn)行體重記錄。在灌胃的第27天開始，連續(xù)3 d按照60 mg/kg的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫力低下，正常小鼠除外。最后1次灌胃后，小鼠斷食不斷水12 h后，處死小鼠。

1.2.4 臟器指數(shù)測定

(1)

式中：m1，臟器質(zhì)量，mg；m2，小鼠體重，g。

1.2.5 小鼠血清UA、CRE和BUN含量的測定

小鼠麻醉后，眼角采血，分離血清，按照試劑盒的要求檢測血清中UA、CRE和BUN的含量。

1.2.6 小鼠血清中IgG和IgM含量的測定

按照試劑盒要求用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清中IgG和IgM含量。

1.2.7 小鼠腎臟抗氧化能力的測定

小鼠處死后，解剖取其腎臟，于冰上進(jìn)行勻漿，3 500 r/min離心10 min，測定上清液中SOD和GSH-PX活力以及MDA含量。

1.2.8 小鼠腎臟HE染色

小鼠處死后，解剖取其腎臟，切小塊置于組織固定液中，充分固定后，對(duì)其進(jìn)行修剪和脫水，經(jīng)浸蠟、包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、至水后，用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)進(jìn)行染色，染色后進(jìn)行脫水、透明和封片處理，最后用光學(xué)顯微鏡對(duì)腎組織病理學(xué)變化進(jìn)行觀察，并使用顯微鏡數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用X±SD表示，使用Origin 94進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖。單因素方差分析進(jìn)行組間比較，t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P<0.05表示具有顯著差異性，P<0.01表示具有極顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 火麻仁蛋白和火麻仁肽的基礎(chǔ)理化性質(zhì)

表1為火麻仁蛋白和火麻仁肽的基礎(chǔ)理化性質(zhì)，火麻仁蛋白中蛋白質(zhì)含量為79.54%，灰分含量為10.52%，可見，本實(shí)驗(yàn)室所制備的火麻仁蛋白中雜質(zhì)含量較少，蛋白質(zhì)含量豐富。通過酶解法制備的火麻仁肽中蛋白質(zhì)含量高達(dá)82.84%，游離氨基酸含量為7.404%，肽含量為75.44%。通過凝膠色譜法對(duì)火麻仁肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，火麻仁肽的分子質(zhì)量分布主要在150～1 000 u，重均分子量為503.7 u，在這個(gè)范圍內(nèi)的肽主要是由2～6個(gè)氨基酸組成的小肽組成。

表1 火麻仁蛋白和火麻仁肽的基礎(chǔ)理化性質(zhì) 單位：%

表2 火麻仁肽的分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of hemp seed peptide

2.2 火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)小鼠體重和臟器指數(shù)的影響

圖1為小鼠體重變化，隨著灌胃時(shí)間的增加，小鼠體重逐漸上升。環(huán)磷酰胺會(huì)引起小鼠體重的下降，火麻仁蛋白和火麻仁肽能夠在一定程度上防止體重的降低。表3為小鼠脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)的變化，可以看出高劑量的火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)正常小鼠脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)無顯著的影響。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)后的小鼠，脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，腎臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，高劑量攝入火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)后的小鼠的脾臟指數(shù)無顯著影響，但是能顯著降低小鼠的腎臟指數(shù)。

圖1 小鼠體重變化(n=6)Fig.1 The weight change of mice (n=6)

表3 火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(n=6)Table 3 Effects of hemp seed protein and hemp seed peptide on viscera index in mice (n=6)

2.3 火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)小鼠血清UA、CRE和BUN含量的影響

圖2為小鼠血清中UA、CRE和BUN含量的變化。正常小鼠血清中UA、CRE和BUN含量與空白組相比沒有發(fā)生顯著的變化。與空白組小鼠相比，小鼠受到環(huán)磷酰胺的誘導(dǎo)后，血清中UA、CRE以及BUN含量顯著升高(P<0.05)，表明腎功能發(fā)生損傷，高劑量的火麻仁蛋白并不會(huì)增加免疫力低下小鼠的腎負(fù)擔(dān)，而且高劑量的火麻仁蛋白和火麻仁肽均顯著降低免疫力低下小鼠血清中UA、CRE和BUN的含量(P<0.05)，且與空白組無顯著差異。相比于火麻仁蛋白，火麻仁肽所呈現(xiàn)的效果更強(qiáng)。

a-血清UA含量；b-血清CRE含量；c-血清BUN含量圖2 小鼠血清UA、CRE和BUN含量變化(n=6)Fig.2 Changes of UA, CRE and BUN in serum of mice (n=6)注：不同小寫字母之間代表具有顯著差異(P<0.05)(下同)

2.4 火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)小鼠血清IgG和IgM含量的影響

圖3為小鼠血清中IgG和IgM含量的變化。從結(jié)果中可以看出，小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)后，血清中IgG和IgM含量顯著降低(P<0.05)，說明環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠免疫力降低。對(duì)于正常小鼠，高劑量攝入火麻仁蛋白或火麻仁肽對(duì)小鼠血清中IgG和IgM含量無顯著的影響。對(duì)免疫力低下的小鼠而言，高劑量的火麻仁蛋白和火麻仁肽使得小鼠血清中IgG含量分別增加2.032、2.03 mg/mL。因此高劑量攝入火麻仁蛋白或火麻仁肽對(duì)正常小鼠和免疫力低下小鼠的免疫系統(tǒng)功能均不會(huì)產(chǎn)生負(fù)擔(dān)。

2.5 火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)小鼠腎臟SOD和GSH-PX活力、MDA含量的影響

如圖4所示，小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)后，腎臟中SOD和GSH-PX活力顯著下降(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。對(duì)于正常小鼠而言，火麻仁蛋白和火麻仁肽均能在一定程度上提高小鼠腎臟的抗氧化酶SOD和GSH-PX的活力，且灌胃火麻仁肽的小鼠抗氧化酶活力更強(qiáng)，但是對(duì)于MDA含量來說，火麻仁蛋白效果更好。對(duì)于免疫力低下的小鼠而言，高劑量的火麻仁肽能夠顯著提高小鼠腎臟中抗氧化酶SOD和GSH-PX活力(P<0.05)，且使得小鼠腎臟中MDA含量顯著降低(P<0.05)，火麻仁蛋白也具有較強(qiáng)的抗氧化作用，但是效果弱于火麻仁肽。

a-血清IgG含量；b-血清IgM含量圖3 小鼠血清中IgG和IgM含量的變化(n=6)Fig.3 Changes of IgG and IgM in serum of mice (n=6)

2.6 火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)小鼠腎臟組織病理學(xué)形態(tài)影響

為了能更直觀的探究火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)小鼠腎功能的影響，對(duì)小鼠腎臟進(jìn)行了HE染色，觀察其病理學(xué)變化，結(jié)果如圖5所示，空白組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管排列整齊，腎小球大小和形狀正常，無炎性細(xì)胞浸潤。經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)后的小鼠腎臟中細(xì)胞核數(shù)量明顯增多，炎性細(xì)胞浸潤明顯，腎小球體積增大，腎小囊囊腔擴(kuò)張，腎間質(zhì)中局部出現(xiàn)纖維化，腎功能受到一定程度的損害。對(duì)于正常小鼠而言，連續(xù)30 d灌胃高劑量的火麻仁蛋白和火麻仁肽后小鼠的腎臟沒有出現(xiàn)損傷現(xiàn)象，腎小球大小正常，無炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。對(duì)于免疫力低下小鼠，經(jīng)灌胃火麻仁蛋白和火麻仁肽后的小鼠腎臟損傷程度明顯減輕，尤其是灌胃火麻仁肽的小鼠，細(xì)胞核數(shù)量明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減輕，腎小球體積減小，腎小囊囊腔擴(kuò)張現(xiàn)象減輕，腎間質(zhì)纖維化消失。由此可見，分別攝入高劑量的火麻仁蛋白和火麻仁肽均不會(huì)對(duì)小鼠腎臟造成損害，并具有一定程度的保護(hù)腎功能的作用。

a-小鼠腎SOD活力；b-小鼠腎GSH-PX活力；c-小鼠腎MDA含量圖4 小鼠腎臟SOD、GSH-PX活力和MDA含量的變化(n=6)Fig.4 Changes of the SOD and GSH-PX activity and the content of MDA in kidney of mice (n=6)

圖5 小鼠腎臟HE染色結(jié)果Fig.5 Results of HE staining of mice kidney

3 結(jié)論與討論

高蛋白飲食在健身愛好者、肥胖患者以及糖尿病患者中非常流行。研究表明，高蛋白飲食能夠幫助肥胖者減輕體重[16]，也可以幫助Ⅱ型糖尿病患者控制血糖[17]，更能幫助運(yùn)動(dòng)人群增長肌肉[18]。大量進(jìn)食蛋白質(zhì)會(huì)增加腎小球過濾和腎血流量，從而增加腎代謝負(fù)擔(dān)。但是不同來源的蛋白質(zhì)對(duì)腎臟產(chǎn)生的影響不同，動(dòng)物性蛋白對(duì)腎臟血流動(dòng)力學(xué)的影響最為明顯，其次是乳蛋白，最后是植物源蛋白[19]。

火麻仁蛋白中含有人體必需的8種氨基酸，氨基酸組成合理，效價(jià)均衡，被稱為優(yōu)質(zhì)完全蛋白[20]。而火麻仁肽作為小分子生物活性肽，具有更強(qiáng)的生物活性。但是它們對(duì)機(jī)體腎功能的影響目前還不明確，因此，探究它們對(duì)腎功能的影響對(duì)進(jìn)一步發(fā)掘其商業(yè)價(jià)值至關(guān)重要。

環(huán)磷酰胺是臨床上常用的一種烷化抗腫瘤藥，具有良好的抗腫瘤效果，但是常伴有免疫抑制、器官損傷，如腎臟、睪丸等損傷等副作用[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)后，小鼠脾臟指數(shù)、血清中IgG和IgM含量明顯降低，說明小鼠免疫功能受到抑制。研究表明，腎損傷模型中的小鼠體內(nèi)激素分泌紊亂，導(dǎo)致腎臟的損傷和腫大[23]。結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)后，小鼠腎臟指數(shù)增大，且HE染色結(jié)果顯示，小鼠腎小球體積增大，腎小囊囊腔擴(kuò)張，體現(xiàn)在生化指標(biāo)上時(shí)，血清中UA、BUN和CRE含量顯著上升，腎臟中抗氧化酶SOD和GSH-PX活力降低，MDA含量上升，因此，經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)后的小鼠免疫功能和腎功能均受到一定程度的損傷。

UA是體內(nèi)嘌呤代謝的產(chǎn)物，血清中UN水平過高會(huì)導(dǎo)致尿酸鹽離子在腎臟的堆積、腎促炎因子的釋放以及增加氧化應(yīng)激，從而引起腎損傷[24]。CRE是人體肌肉代謝的產(chǎn)物，BUN是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，二者均是通過腎小球過濾排出體外[25]，二者在血液中的水平與腎功能水平具有密切聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量攝入火麻仁蛋白和火麻仁肽均不會(huì)引起小鼠血液中UA、CRE和BUN水平發(fā)生顯著的變化，腎臟HE染色結(jié)果也顯示出二者對(duì)腎小球結(jié)構(gòu)沒有明顯的影響。對(duì)于免疫力低下的小鼠，相對(duì)于火麻仁蛋白，高劑量攝入火麻仁肽對(duì)減緩環(huán)磷酰胺引起的腎臟損害效果更為顯著。這可能是因?yàn)橄鄬?duì)于蛋白質(zhì)，小肽具有更強(qiáng)的生理活性和營養(yǎng)價(jià)值，而且生物活性肽在機(jī)體中能夠起到載體作用，幫助將所食用的營養(yǎng)物質(zhì)更快速的轉(zhuǎn)運(yùn)到各種細(xì)胞、組織和器官[26]，從而增強(qiáng)了器官的生理機(jī)能。

氧化應(yīng)激在各種腎病的發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，是導(dǎo)致慢性腎衰竭[27]、急性腎損傷等[28]的主要致病因素之一，因此降低機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，對(duì)預(yù)防腎病的發(fā)生具有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分別攝入高劑量火麻仁蛋白和火麻仁肽對(duì)正常小鼠和免疫力低下小鼠的腎臟抗氧化能力均能起到增強(qiáng)作用，且相比于蛋白，肽的抗氧化能力更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)所用的火麻仁肽重均分子量為503.7 u，主要由2～6個(gè)氨基酸組成的小肽組成，研究表明，小分子肽段與自由基反應(yīng)時(shí)具有更小的空間位阻，因此表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[29]。

綜上所述，火麻仁蛋白和火麻仁肽是優(yōu)質(zhì)的蛋白來源，高劑量攝入既不會(huì)對(duì)正常機(jī)體的腎功能造成損害，也不會(huì)對(duì)免疫力低下機(jī)體的腎功能造成損害，而且二者具有一定的腎功能保護(hù)和抗氧化作用。