曹慶龍，雷橋，2，3*，吳浩，高文婧

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

抗菌活性包裝是近年來功能性包裝的研究熱點(diǎn)之一，其主要實(shí)現(xiàn)途徑包括負(fù)載活性物質(zhì)的微囊、復(fù)合膜、涂膜、靜電紡絲等[1-4]。其中對(duì)活性物質(zhì)的裝載量及緩釋性能是需要重點(diǎn)解決的問題。氣凝膠作為一種新型功能材料，其優(yōu)良的孔隙率與比表面積為其在食品、醫(yī)藥、生物科學(xué)、隔音隔熱、吸附等領(lǐng)域提供了結(jié)構(gòu)支持[5-8]。研究表明，氣凝膠的三維孔洞結(jié)構(gòu)可以裝載活性物質(zhì)并起到緩釋的作用，有望解決上述包裝關(guān)鍵問題[9-11]。

目前對(duì)于氣凝膠的研究大多集中于硅類氣凝膠，相對(duì)于這種無機(jī)類氣凝膠，多糖/蛋白類氣凝膠則表現(xiàn)出更好的生物相容性與生物可降解性[12]。DHARUNYA等[13]以姜黃素作為交聯(lián)劑，交聯(lián)膠原蛋白制備的氣凝膠可以用于人工骨架。ANJA等[14]發(fā)明了一種可生物降解的有機(jī)氣凝膠，可作為腸外給藥的診斷劑和治療劑。但總的來說，多糖/蛋白類氣凝膠裝載和緩釋活性物質(zhì)方面的研究仍較少。

在活性包裝應(yīng)用中，精油為抗菌劑之一有著較為廣泛的應(yīng)用。丁香精油的主要成分是丁香酚，除了具有較強(qiáng)的殺菌能力之外，對(duì)流感病毒也有一定的抑制作用，可入藥，用于降血壓，作為局部鎮(zhèn)痛藥用于齲齒等[15-16]。本研究選用丁香精油作為包裝活性物質(zhì)。

本研究的前期工作對(duì)普魯蘭多糖(pullulan，PUL)氣凝膠的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化并探討了其應(yīng)用可行性[17]。亦有學(xué)者探討了乳清分離蛋白(whey protein isolate，WPI)氣凝膠的機(jī)械性能與應(yīng)用性[18-20]。由于多糖類PUL氣凝膠吸濕性高、受壓易變形，而蛋白類WPI氣凝膠質(zhì)地則較脆，結(jié)構(gòu)易崩塌，若將二者復(fù)合則可能改良性能。為此，本文在前期單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，選出3個(gè)最顯著因素：PUL添加量、pH與凝膠溫度，并以此進(jìn)行二次回歸實(shí)驗(yàn)。采用 Box-Behnken 模型，設(shè)置3因素3水平，以氣凝膠的丁香精油裝載性能為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)其吸濕性、抗壓性能、熱力學(xué)性能、微觀結(jié)構(gòu)及精油釋放性能進(jìn)行測(cè)試，旨在為活性包裝研究提供一種新的途徑，為多糖/蛋白類氣凝膠在裝載緩釋領(lǐng)域的應(yīng)用提供可行方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

乳清分離蛋白，美國(guó)ISOPURE公司；普魯蘭多糖(純度>98%，Mw:342～710 000)，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；丁香精油，吉安市中香天然植物有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、溴化鉀，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；去離子水，實(shí)驗(yàn)室提供。以上試劑除注明外均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)SMS公司；S3400 N型掃描電子顯微鏡，Hitachi(日立)公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省鞏義市科瑞儀器有限公司；SCIENTZ-10 N型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Nicolet iZ10型傅立葉變換顯微紅外成像光譜儀，Thermo Scientific有限公司；LHS-500HC-II型恒溫恒濕箱、YP202 N型電子天平、雷磁PHS-3C pH計(jì)，上海精密科學(xué)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 WPI-PUL復(fù)合氣凝膠的制備

用電子天平稱取20 g WPI粉末置于潔凈燒杯中，添加一定量PUL粉末，各加100 mL去離子水在25 ℃水浴條件下充分?jǐn)嚢枋怪旌?。肉眼不可見白色懸浮物后再繼續(xù)攪拌5 min?；靹蚝竺芊猓? ℃冰箱靜置12 h,使其充分水合。后加入0.585 g NaCl，并用1 mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)其溶液pH，于25 ℃恒溫水浴攪拌30 min。將攪拌后分散均勻的懸浮液除去溶液上層泡沫后倒入2 mL離心管，一定溫度條件下水浴加熱30 min,使之充分形成WPI-PUL水凝膠，再置于-20 ℃冰箱冷凍12 h。將冷凍完全的樣品置于真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥(規(guī)程：-45 ℃，15 Pa，2 d)，制得WPI-PUL復(fù)合氣凝膠。制備完成的樣品氣凝膠測(cè)定其丁香精油裝載率，并以此為響應(yīng)值，采用 Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析結(jié)果得出優(yōu)化方案并驗(yàn)證。精油釋放性能、抗壓性能等性能測(cè)試均基于此最優(yōu)方案進(jìn)行。

1.3.2 精油裝載

采用AHMADI等[18]的方法并作修改，將WPI-PUL復(fù)合氣凝膠樣品浸入丁香精油中，在30 ℃恒溫密封條件下浸載3 h，充分吸附精油至氣凝膠的孔道中。后取出置于敞開培養(yǎng)皿上，30 ℃恒溫使其充分揮發(fā)至恒重。裝載率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：T代表裝載率，%；m0代表未浸精油前氣凝膠的初始質(zhì)量，g；mt代表揮發(fā)至恒重的氣凝膠質(zhì)量，g。

1.3.3 精油釋放

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 31604.1—2015，以95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇溶液和蒸餾水作為食品模擬液。將載有精油的WPI-PUL復(fù)合氣凝膠樣品分別完全浸入50 mL 95%乙醇溶液和蒸餾水中，25 ℃水浴條件下密封磁力攪拌，每隔10 min取樣3 mL溶液，并補(bǔ)充3 mL 對(duì)應(yīng)溶劑。對(duì)取出液進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)，對(duì)照組為同等處理的未載油氣凝膠樣品浸泡液，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算精油釋放濃度[21]。釋放率R按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：R代表釋放率，%；Ci代表第i次取樣時(shí)精油濃度，g/mL；m代表精油裝載量，g。

1.3.4 吸濕率測(cè)定

采用SU等[22]的方法并作修改,將氣凝膠置于相對(duì)濕度為83.6%，溫度為30 ℃的恒溫恒濕箱中，每隔一定時(shí)間稱取一次氣凝膠重量，直至氣凝膠重量恒定。氣凝膠吸濕率按公式(3)計(jì)算:

(3)

式中：H代表吸濕率，%；W代表吸濕一定時(shí)間后氣凝膠的質(zhì)量，g；W0代表未吸濕前氣凝膠的初始質(zhì)量，g。

1.3.5 抗壓性能測(cè)試

將裝載精油前后的WPI-PUL復(fù)合氣凝膠切成高度為1 cm的圓柱狀樣品。參數(shù)設(shè)定如下，探頭：36R平面探頭；測(cè)前速度：1.0 mm/s；測(cè)定速度：0.1 mm/s；測(cè)后速度：1.0 mm/s；應(yīng)變：75%。在獲取的應(yīng)力-應(yīng)變曲線上，取應(yīng)變范圍8%～15%線性區(qū)域的斜率，記作氣凝膠的壓縮模量[18]。

1.3.6 掃描電鏡分析

分別將裝載前后的WPI-PUL復(fù)合氣凝膠樣品沿橫切面切成1 mm厚的薄片，粘于導(dǎo)電膠上噴金120 s后，使用掃描電鏡觀察氣凝膠表面的微觀結(jié)構(gòu)[23]。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析

分別將各組樣品碾碎后，與KBr混合。混合比例為1∶100(質(zhì)量比)。再進(jìn)行研磨，壓片。傅里葉紅外光譜的掃描范圍為450～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.8 熱重分析(thermogravimetric analysis,TG)

分別將各組樣品(5～10 mg)置于Al2O3坩堝中，以20 mL/min流速的氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣和吹掃氣，以10 ℃/min的加熱速率從30 ℃加熱到600 ℃[24]。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

文中數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)平均值，采用SPSS 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析并用Orgin 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

采用 Box-Behnken 模型，以PUL添加量(A)、凝膠溫度(B)與pH(C)為考察因素，設(shè)置3因素3水平，以氣凝膠的丁香精油裝載性能為響應(yīng)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及水平選擇見表1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 WPI-PUL復(fù)合氣凝膠響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of WPI-PUL composite aerogel response surface experiments

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到方程如下：

Y=7.336 00-0.582 70A+5.231 80B+10.915 50C+0.013 100AB+0.017 833AC+0.062 500BC-5.914 44E-003A2-0.038 230B2-1.105 75C2

式中，Y為復(fù)合氣凝膠的丁香精油預(yù)測(cè)裝載率，%；A為PUL添加量，mg/mL；B，pH；C為凝膠溫度，℃。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

3種顯著影響因素(PUL添加量、pH、凝膠溫度)的響應(yīng)面和等高線如圖1所示。響應(yīng)面皆呈開口向下的凸面，說明存在響應(yīng)最大值[25]。響應(yīng)面的陡緩程度和等高線的形狀反應(yīng)了因素交互作用的強(qiáng)弱。響應(yīng)面走勢(shì)陡表明影響顯著，反之則說明影響不明顯。等高線近橢圓則表明兩因素之間交互作用顯著；近圓則說明交互作用不顯著[26]。結(jié)果表明,PUL添加量(A)和pH(B)交互作用對(duì)響應(yīng)面值的影響顯著，PUL添加量(A)和凝膠溫度(C)、pH(B)和凝膠溫度(C)交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。

a-pH、PUL添加量；b-凝膠溫度、PUL添加量；c-凝膠溫度、pH圖1 PUL添加量、pH、凝膠溫度交互作用對(duì)丁香精油裝載率的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.1 Response surface curves and contour lines of clove essential oil loading rate by interaction of PUL addition, pH and gel temperature

根據(jù)Design-Expert軟件分析，得到丁香精油最大裝載率的理論最佳條件為：PUL添加量為55.86 mg/mL, pH值7.87，凝膠溫度83.85 ℃。該條件下預(yù)計(jì)得到的復(fù)合氣凝膠丁香精油裝載率為254.113%?？紤]到實(shí)際操作，取PUL添加量55 mg/mL, pH值7.9，凝膠溫度84 ℃，實(shí)際丁香精油裝載率為254.23%，與預(yù)測(cè)值非常接近，說明擬合結(jié)果可以真實(shí)地反映各因素對(duì)復(fù)合氣凝膠丁香精油裝載率的影響，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.2 精油釋放性能分析

圖2為裝載丁香精油的WPI-PUL復(fù)合氣凝膠在蒸餾水及95%乙醇中的動(dòng)態(tài)釋放曲線，曲線的斜率均隨時(shí)間遞減，表明其釋放速率隨浸漬時(shí)間的延長(zhǎng)而放緩，前10 min表現(xiàn)出最大釋放速率。在水體系中140 min 后釋放速率放緩，并在360 min后趨于平衡，釋放率為48.94%；95%乙醇體系中，180 min后釋放速率放緩，并在420 min后趨于平衡，釋放率為65.59%。記平衡數(shù)值為總釋放率，平衡數(shù)值對(duì)應(yīng)時(shí)間越大，則說明復(fù)合氣凝膠的緩釋性能最好，從中可以看出在95%乙醇體系中裝載丁香精油的復(fù)合氣凝膠緩釋性能更好。2種體系釋放總體趨勢(shì)相似，但總釋放量均有所增大，這是由于丁香精油在乙醇中具有更大的溶解度。擬合各釋放曲線得到的模擬方程如表4所示。

圖2 復(fù)合氣凝膠精油釋放曲線Fig.2 Essential oil release curve of composite aerogels

表4 氣凝膠精油釋放率的非線性模擬方程Table 4 Simulation equation of aerogel essential oil release curve

2.3 吸濕性能分析

氣凝膠產(chǎn)品本身含水量很低，因?yàn)樵诶鋬龈稍镞^程中大部分的水分已被除去。由于氣凝膠本身的多孔洞結(jié)構(gòu)具有一定的吸水性，而吸水之后的氣凝膠不易保存，更容易腐敗變質(zhì)，對(duì)于裝載活性藥物的適用性也大大降低[20]。圖3為復(fù)合氣凝膠的吸濕率隨時(shí)間的變化曲線，曲線的斜率即為吸濕速率。復(fù)合氣凝膠在前6 h表現(xiàn)出較大的吸濕速率，隨后吸濕速率放緩，并于24 h后達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，最終平衡吸濕率為11.41%。

2.4 抗壓性能分析

圖4反映了抗壓測(cè)試過程中復(fù)合氣凝膠在勻速形變過程中應(yīng)力的變化情況。未裝載精油的氣凝膠樣品曲線前18%區(qū)域(以橫坐標(biāo)應(yīng)變衡量，下同)近似為一條直線，取8%～15%區(qū)域的斜率記作復(fù)合氣凝膠的壓縮模量衡量其抗壓性能，其值越大說明抗壓性能越好，未裝載精油的氣凝膠壓縮模量為21.745 MPa，具有良好的抗壓性能。壓縮形變45%～50%后應(yīng)力大幅減小，這是因?yàn)閴嚎s過程中氣凝膠部分結(jié)構(gòu)坍塌導(dǎo)致應(yīng)力變小。壓縮形變50%后應(yīng)力顯著增大，這可能是因?yàn)闅饽z孔道接近完全壓縮，結(jié)構(gòu)難以改變所致。裝載丁香精油后復(fù)合氣凝膠的壓縮模量有所下降，這可能是由于干燥除去復(fù)合氣凝膠表面多余精油時(shí)，其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生輕微崩塌，但其抗壓性能(11.247 MPa)仍能滿足正常應(yīng)用需求。

圖4 氣凝膠裝載精油前后的應(yīng)變-應(yīng)力曲線Fig.4 Strain-stress curves of aerogels before and after loading essential oils

2.5 掃描電鏡分析

復(fù)合氣凝膠裝載丁香精油前后的微觀結(jié)構(gòu)如圖5所示。

a-未裝載丁香精油；b-裝載丁香精油圖5 氣凝膠裝載精油前后的微觀結(jié)構(gòu)Fig.5 Microstructure of aerogels before and after loading essential oils

圖5-a為復(fù)合氣凝膠未裝載丁香精油的微觀結(jié)構(gòu)圖?？椎婪植驾^為均一，孔徑分布納米級(jí)到微米級(jí)，反映出在響應(yīng)面優(yōu)化條件下制備的復(fù)合氣凝膠仍有較好的開孔情況。圖5-b為復(fù)合氣凝膠裝載丁香精油的微觀結(jié)構(gòu)圖，可以看出，精油被均勻地吸附入凝膠孔道中，孔道結(jié)構(gòu)依然存在并未被精油破壞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吸附并不僅僅存在于氣凝膠表面，復(fù)合氣凝膠中心部分仍有較多精油被吸附?？讖皆叫?，吸附作用越好，這與毛細(xì)管吸附作用類似。

2.6 傅里葉紅外分析

圖6為復(fù)合氣凝膠及其裝載丁香精油前后的傅里葉紅外波譜。1 025 cm-1處附近為PUL中醚鍵的伸縮振動(dòng)，而1 657 cm-1處附近則是WPI的特征峰，為C—N 的伸縮振動(dòng)。相對(duì)于空白組，裝載丁香精油組在1 605 cm-1、1 516 cm-1、1 458 cm-1處出現(xiàn)了3個(gè)吸收峰，這為丁香酚苯環(huán)的特征峰，3 015 cm-1處為苯環(huán)上C—H的伸縮振動(dòng)。添加了丁香精油后對(duì)復(fù)合氣凝膠的紅外光譜總體影響不大，主要因?yàn)閃PI、PUL與丁香酚有相似的官能團(tuán)。空白組3 293 cm-1處出現(xiàn)一較寬吸收峰，為分子間O—H的伸縮振動(dòng)，裝載精油后該峰強(qiáng)度均有所變化，并發(fā)生了不同程度的偏移，說明體系有新的氫鍵形成，反映出精油吸附到復(fù)合氣凝膠孔道后，主要是通過分子間氫鍵與之結(jié)合。

圖6 氣凝膠裝載精油前后的傅里葉紅外分析Fig.6 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of aerogels before and after loading essential oils

2.7 熱重分析

圖7為復(fù)合氣凝膠裝載丁香精油前后的TG曲線(30～600 ℃溫度范圍)?？瞻捉M第一段顯著熱失重出現(xiàn)在30～110 ℃，主要原因是氣凝膠吸附的空氣中水分的逸出?？瞻捉M曲線在這一階段的差異反映了高濃度PUL的氣凝膠具有更強(qiáng)的吸濕性；110～290 ℃的熱重變化則是由于PUL的部分分解和水分的進(jìn)一步散失造成的；290～350 ℃則產(chǎn)生了WPI與PUL的大規(guī)模裂解，期間復(fù)合氣凝膠質(zhì)量損失約為70%。溫度高于350 ℃之后，質(zhì)量損失速度減緩，這部分損失是剩余殘?jiān)蓟沟玫踉貋G失造成的。裝載丁香精油的復(fù)合氣凝膠第一段明顯熱失重則是在120～180 ℃，質(zhì)量損失高達(dá)71%，這階段主要是丁香精油的揮發(fā)所致。

圖7 氣凝膠裝載精油前后的TG曲線Fig.7 TG curves of aerogels before and after loading essential oils

3 結(jié)論

PUL添加量、pH、凝膠溫度、凝膠時(shí)間、交聯(lián)劑添加量、冷凍干燥時(shí)間等均對(duì)WPI-PUL復(fù)合氣凝膠的性能有著一定影響。前期通過在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，選出3個(gè)最顯著因素：PUL添加量、pH與凝膠溫度。通過Box-Behnken 模型以氣凝膠的丁香精油裝載性能為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化并驗(yàn)證得到最優(yōu)制備條件為：PUL添加量55 mg/mL, pH值7.9，凝膠溫度84 ℃。最優(yōu)條件下制得復(fù)合氣凝膠樣品對(duì)丁香精油有著良好的裝載性能及緩釋性能，最大裝載率為254.23%。在水體系中，釋放360 min 后達(dá)到最大釋放率，為48.94%，釋放方程：r=6.456E-6t3-0.004t2+0.647t+9.339；在95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇體系中，釋放420 min后達(dá)到最大釋放率，為65.59%，釋放方程：r=8.106E-6t3-0.005t2+0.850t+11.359(95%乙醇)。平衡吸濕率為11.41%，相比純WPI或PUL氣凝膠均有所降低，更適于活性物質(zhì)的裝載與貯藏。裝載丁香精油前壓縮模量21.745 MPa，有著較好的抗壓性能，裝載后仍有11.247 MPa，可滿足正常應(yīng)用需求。

綜合來看，選用PUL添加量55 mg/mL, pH值7.9，凝膠溫度84 ℃制備的WPI-PUL復(fù)合氣凝膠可以得到有著良好的機(jī)械強(qiáng)度、丁香精油裝載率和緩釋性能以及低吸濕率的氣凝膠產(chǎn)品，適用于活性包裝載體、食品微膠囊及生物醫(yī)藥載體的開發(fā)與應(yīng)用，同時(shí)可為氣凝膠的制備提供了指導(dǎo)意義。