白賀霞，左明明，盤曉芳，趙新芳，韓璇雪

布魯氏桿菌病是世界上最常見的人獸共患傳染病之一，每年有 50多萬人感染布魯氏桿菌病。盡管人們已經(jīng)努力嘗試控制布魯氏桿菌病的傳播，但它仍然世界上大多數(shù)地方流行，特別是在發(fā)展中國家[1-3]。布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌引起的[4-6]，人類是這種細菌的隨機宿主。我國所有省市自治區(qū)均有人感染布魯氏桿菌的病例報告，但發(fā)病人群仍以牧民為主。近些年來，新疆地區(qū)人和家畜的布魯氏桿菌病發(fā)病率均呈急速的高發(fā)病趨勢，據(jù)不完全統(tǒng)計每年新疆因布魯氏桿菌病導(dǎo)致的直接經(jīng)濟損失可達上億元。

人類免疫系統(tǒng)與布魯氏桿菌之間的相互作用對于病原體的清除或存活是必不可少的[7-8]。先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)都參與了對布魯氏桿菌感染的防控，這主要依賴于細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。因此，抗原提呈細胞(巨噬細胞和樹突狀細胞)的貢獻以及CD4和CD8T淋巴細胞的誘導(dǎo)在這些免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。大量證據(jù)及經(jīng)驗表明，復(fù)雜疾病的特征受到多個基因相互作用的共同影響[9-12]。而目前對布魯氏桿菌病的免疫分子失調(diào)機制仍然未達成共識。需要更深入的研究來探討布魯氏桿菌感染過程中的免疫分子失調(diào)以及潛在的調(diào)控機制。

本文從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取布魯氏桿菌病患者和對照組的基因表達譜數(shù)據(jù)，整合了對布魯氏桿菌病患者和健康人的外周血的免疫相關(guān)差異表達基因。通過生物信息學(xué)分析方法探討布魯氏桿菌病的關(guān)鍵失調(diào)免疫基因和分子機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從美國國家生物信息中心(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GEO公共數(shù)據(jù)庫調(diào)取GSE69597獲取布魯氏桿菌病人及健康對照的全血轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)。

1.2 差異免疫基因的鑒定 使用R語言DESeq2對布魯氏桿菌病患者和對照之間的基因表達進行差異分析，設(shè)置篩選條件P<0.05鑒定差異表達基因(DEGs)。使用immport數(shù)據(jù)庫調(diào)取差異表達基因中免疫相關(guān)的基因集(immune-DEGs)。

1.3 免疫基因集GO和KEGG富集分析 使用Enrichr(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)在線富集工具對鑒定到的immune-DEGs進行生物功能(GO)和KEGG信號途徑分析。P<0.05為富集有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 免疫基因集蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析(PPI)及核心(hub)調(diào)控基因的鑒定 我們將immune-DEGs上傳到STRING數(shù)據(jù)庫，并篩選綜合得分>0.4的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)。用Cytoscape軟件(3.8.0版)鑒定PPI網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的前10個基因為核心(hub)基因。

1.5 ROC曲線 我們使用SPSS 24.0對hub基因進行受試者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲線分析。曲線下面積越大，則基因的診斷能力越強。

1.6 樣本收集 各收集10例急性期首次確診的布魯氏桿菌患者及健康對照的外周血樣本。所有的樣本均獲得了患者的知情同意并獲得了昌吉市人民醫(yī)院的倫理委員會批準(zhǔn)。

1.7 實時定量PCR(qRTPCR)檢測TNF和IFNG的mRNA水平 利用Trizol(Invitrogen)制備20例外周血樣本的總RNA。根據(jù)制造商的說明利用PrimescriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒進行qRTPCR反應(yīng)。以GAPDH 為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT的方法進行數(shù)據(jù)分析。所有的實驗均進行了3次重復(fù)。

1.8 單樣本基因集富集分析(ssGSEA) 我們使用ssGSEA算法來評估布魯氏桿菌患者及對照的全血中28種免疫細胞的免疫評分。P<0.05表明布魯氏桿菌患者與對照組之間的免疫細胞含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.9 流式細胞術(shù)檢測Th1/Th2/Th17細胞和Treg細胞比例 取5例布魯氏桿菌患者和5例健康對照的100 μL EDTA抗凝外周血加入流式管中，分別加入5 μL流式抗體CD4-PECY7、CD25-BB515和CD127-PE用作Treg細胞的檢測；CD4-FITC、CD183-PECY5和CD196-PE用作Th1/Th2/Th17細胞的檢測，抗體均購自美國BD公司，混勻室溫避光孵育15 min后，加入溶血素2 mL。室溫孵育5 min后，1 500 r/min離心5 min，PBS洗1遍后，加入300 μL PBS重懸上流式機(美國貝克曼，DXflex)檢測。

2 結(jié) 果

2.1 差異免疫基因的鑒定 我們共鑒定到布魯氏桿菌病患者與對照之間的差異表達的基因(P<0.05)有4 924個，其中上調(diào)表達基因2 510個，下調(diào)基因2 414個。通過immport數(shù)據(jù)庫篩選出免疫相關(guān)的差異表達基因共390個，上調(diào)基因208個，下調(diào)基因182個。見表1，展示了上調(diào)和下調(diào)變化倍數(shù)最大的前十個差異表達基因。

表1 差異表達基因

2.2 免疫基因的GO和KEGG富集分析 GO功能注釋分析結(jié)果表明，對于390個 免疫相關(guān)mRNAs的靶點，生物過程(BP)最豐富的術(shù)語是“cytokine-mediated signaling pathway(細胞因子介導(dǎo)的信號通路)”(圖1A)和“cellular response to cytokine stimulus(細胞對細胞因子刺激的反應(yīng))”，細胞組分(CC)中的“integral component of plasma membrane(質(zhì)膜的組成部分)”和“T cell receptor complex(T細胞受體復(fù)合物)”(圖1B)，以及分子功能(MF)中的“cytokine receptor activity(細胞因子受體活性)”和“protein tyrosine kinase activity(蛋白酪氨酸激酶活性)”(圖1C)。KEGG途徑分析結(jié)果表明，富集最高的幾條通路是T cell receptor signaling pathway(T細胞受體信號通路)，B cell re-ceptor signaling pathway(B細胞受體信號通路)，Th17 cell differentiation(Th17細胞分化)(圖1D)。

注：A差異基因參與的生物學(xué)進程；B差異基因參與的細胞成分；C差異基因參與的分子功能；D差異基因參與的信號通路

2.3 免疫基因集PPI和hub基因的鑒定 為了在上述390個免疫相關(guān)差異表達基因中識別hub基因，我們篩選了在PPI網(wǎng)絡(luò)中連接度最大的前10個基因(圖2A)。包括TNF、IL6、AKT1、IL4、TLR4、CTLA4、IFNG、STAT1、TLR2和CD86。與正常對照(Control)組相比，IFNG、STAT1、CTLA4和TNF在布魯氏桿菌患者組中顯著高表達，其余的則是低表達(圖2B)。

A：預(yù)測到的hub基因；B：預(yù)測的hub基因mRNA表達水平柱狀圖；①：P<0.05；②：P<0.01；③：P<0.001。

2.4hub基因的ROC曲線 ROC曲線結(jié)果顯示，IFNG的曲線下面積大于0.7，說明其對布魯氏桿菌病具有良好的診斷意義，其余基因的曲線下面積均小于0.7，見圖3。

圖3 hub基因ROC曲線

2.5 關(guān)鍵基因的驗證 收集布魯氏桿菌病患者和健康對照的外周血樣本，利用qRTPCR的實驗方法檢測IFNG和TNF的mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，IFNG和TNF在布魯氏桿菌病患者中表達上調(diào)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。進一步說明他們對布魯氏桿菌病具有良好的診斷意義。

①：P<0.001

2.6 單樣本基因集富集分析(ssGSEA) 單樣本基因集富集分析結(jié)果顯示全血中與control(對照組)組相比Activated CD4T(活化型CD4T細胞)、Effector memeory CD4T(效應(yīng)型CD4T細胞)、Effector memeory CD8T(效應(yīng)記憶型CD8T細胞)、Type 2 T helper(2型T輔助細胞因子-Th2)在布魯氏桿菌病患者組有顯著上升；而效應(yīng)型B細胞(Activated B)、嗜酸性粒細胞(Eosinophil)、未成熟B(Immature B)、巨噬細胞(Macrophage)、記憶B(Memory B)、自然殺傷T細胞(Natural killer T，NKT)、中性粒細胞(Neutrophil)、漿細胞樹突狀細胞(Plasmacytoid dendritic)、調(diào)節(jié)性T細胞-Treg(Regulatory T)則下降，見圖5。

①：P<0.05；②：P<0.01；③：P<0.001；ns：無差別

2.7 流式細胞術(shù)驗證Th1/Th2/Th17細胞和Treg細胞比例 流式結(jié)果顯示，與健康對照組相比，布魯氏桿菌病患者外周血中Th2和Th17細胞比例增高，而Th1細胞和Treg細胞比例則降低，見圖6。

A：Th1/Th2/Th17細胞比例；B：Treg細胞比例

3 討 論

隨著全球?qū)Σ剪斒蠗U菌病研究的深入，發(fā)現(xiàn)免疫損傷在該病的發(fā)生發(fā)展，尤其是慢性化中起重要作用[13]。宿主免疫反應(yīng)在功能上分為先天性和適應(yīng)性免疫。而布魯氏桿菌為胞內(nèi)寄生菌，故以適應(yīng)性細胞免疫為主[14]。而適應(yīng)性免疫由T淋巴細胞(細胞免疫)以及B淋巴細胞(體液免疫)組成[15]。我們的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活化和未成熟型B細胞在布魯氏桿菌患者顯著低表達，而活化的CD4+T細胞和CD8+T細胞均在人布魯氏桿菌病患者中顯著高表達。布魯氏桿菌感染宿主后，人體對病原學(xué)的清除，主要是T淋巴細胞在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。T淋巴細胞由不同的細胞亞群組成，各亞群T細胞通過分泌動態(tài)平衡的多種不同細胞因子來維持人體正常的免疫功能，一旦這種平衡被打破就可以導(dǎo)致機體內(nèi)免疫紊亂[16]。作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的一部分,CD8+T細胞通過鑒定和殺死受損宿主細胞來控制細胞內(nèi)感染[17-18]。CD4+T細胞在外來抗原作用下分化為各種效應(yīng)T細胞參與免疫應(yīng)答。Zheng等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者個體相比，人布魯氏桿菌病患者中CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例顯著升高。因此，我們認為人布魯氏桿菌病患者存在T淋巴細胞免疫功能異常，CD4+T和CD8+T細胞可能是影響布魯氏桿菌病進展的重要因素。

另一方面，本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)鑒定了10個hub基因。其中，IFN-γ和TNF在布魯氏菌病患者中顯著高表達，TNF在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于最核心的調(diào)控地位。當(dāng)人體感染病原體后，在不同的細胞因子和環(huán)境作用下，CD4+T細胞可以分化成不同類型細胞，如Thl，Th2，Thl7，Treg等細胞亞群釋放IFN、TNF、IL-4等細胞因子，進一步誘導(dǎo)細胞免疫或體液免疫應(yīng)答[20]。在Mosmann描述Th1/Th2“二分法”概念中，布魯氏桿菌病再次被用作感染與干擾素-γ(IFN-γ)產(chǎn)生相關(guān)的模型[21]。因此，細胞免疫和Th1細胞因子(IFN-γ，腫瘤壞死因子α)在布魯氏桿菌感染結(jié)果中的關(guān)鍵作用得到了證實。而本研究通過ROC曲線同樣驗證了這一結(jié)果。

在KEGG富集結(jié)果中鑒定了T 細胞受體信號通路和Th17細胞分化的顯著富集。CD4+T細胞的三個亞群，Th1、Th2和Th17，是細胞內(nèi)細菌免疫反應(yīng)的中心參與者。IL-17A是Th17細胞產(chǎn)生的標(biāo)志性細胞因子[22-25]。雖然Th1細胞在布魯氏桿菌病中的保護作用已被證明，但確定Th17細胞在布魯氏桿菌免疫中的確切作用正在成為一個活躍的研究領(lǐng)域。而我們的數(shù)據(jù)分析顯示，Th17信號通路與布魯氏桿菌病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。

綜上所述，為了能更好的明確布魯氏桿菌感染后宿主體內(nèi)的免疫調(diào)控，為今后患者的有效診治提供可靠的理論依據(jù)。我們通過生物信息學(xué)分析了布魯氏桿菌感染對免疫的影響。鑒于宿主對布魯氏桿菌的應(yīng)答主要由免疫細胞介導(dǎo)，因此闡明感染患者體內(nèi)免疫細胞的調(diào)控機制，以及明確調(diào)控宿主體內(nèi)免疫細胞的靶點，可以為將來設(shè)計針對布魯氏桿菌的藥物和疫苗提供是至關(guān)重要的理論基礎(chǔ)。

利益沖突：無