郭麗民，席進孝，葛亞俊，王宇萌，苗克軍，吳 斌，徐大琴

鼠疫是一種流行在嚙齒動物間通過蚤傳播的自然疫源性疾病，病原體為鼠疫耶爾森菌。鼠疫菌對糖、醇的酵解能力是生化分型的重要指標之一。紀樹立等[1]根據(jù)鼠疫菌生物學特征，將我國不同類型鼠疫疫源地分離的鼠疫菌株分為17個生態(tài)型。段永明等[2]將甘肅省鼠疫疫源地分離的菌株分為阿爾金型、青藏型、祁連型和甘寧黃鼠型。不同生態(tài)型的鼠疫菌均占有一塊各自相對獨立的疫源地分布區(qū)，而且菌株在分布區(qū)內(nèi)占有優(yōu)勢。各疫源地動物間鼠疫流行強度的差異，使得菌株在適應環(huán)境的變化過程中遺傳特征發(fā)生變化，這種變異被保存下來，造成不同疫源地間菌株在基因上的差異。由于甘肅省動物間鼠疫流行猛烈，常波及人間鼠疫疫情流行，而且非法獵捕販運旱獺容易造成鼠疫遠距離傳播，為此需要利用簡單經(jīng)濟的分子分型方法對鼠疫疫情進行溯源分析。VNTR在鼠疫菌基因組中分布廣泛，可以通過分析多個位點的變異信息，進行鼠疫菌基因分型和進化分析，即MLVA(Multiple locus variable number tandem repeat analysis)方法。本實驗室早期利用15個VNTR位點進行鼠疫菌株的基因分型，只將鼠疫菌株分為兩個群，不能區(qū)分不同生化型的鼠疫菌株[3]。本次研究采用MLVA(14+12)分級分型的方法對甘肅省鼠疫菌株進行基因分型[4]，以期建立甘肅省鼠疫菌VNTR位點多態(tài)性數(shù)據(jù)庫，為鼠疫疫情的鑒定溯源提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及DNA制備 選取甘肅省1962-2014年間198株鼠疫菌，其中甘寧黃鼠型菌株6株、青藏型菌株128株、祁連型菌株46株、阿爾金型菌株18株。菌株保藏于甘肅省疾病預防控制中心鼠疫防制科。鼠疫菌DNA提取參照文獻[5]進行，置-20 ℃保存。

1.2 儀器及試劑 PCR基因擴增儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，3730(美國ABI公司)，5415D小型高速離心機(德國Eppendorf公司)，水平電泳儀(北京六一儀器廠)。PCR擴增試劑購自北京全式金生物技術有限公司，DL1000(寶生物有限公司)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)，低分子量Markers和500liz、1200liz內(nèi)標marker(北京賽百盛基因技術有限公司)。

1.3 方 法

1.3.1 引物 采用14+12對VNTR引物[4,6]，引物信息見表1。

表1 14+12對MLVA引物序列信息

1.3.2 PCR反應體系及條件 反應體系：Premix Ex Taq 12.5 μL，10 μmol/L 上下游引物各1.0 μL，模板DNA 2 μL，補水至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，最適退火溫度1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃ 延伸5 min。引物為M58、MS56、MS38、M21、M15、M61、M25、M23 時，退火溫度為60 ℃，引物為MS09、N2486、MS73、MS41、M34、M33、M22、M43、M28、M29時，退火溫度為55 ℃，引物為N3779、N2896、N0865、N2976、N1606、N2577、N3773、N2117體系的退火溫度為52 ℃ 1 min。

1.3.3 水平瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL PCR產(chǎn)物，與1 μL 6×loading buffer混合后，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析有無產(chǎn)物和非特異性擴增、核對擴增產(chǎn)物大小。

1.3.4 PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)的確定 將PCR產(chǎn)物送專業(yè)技術服務公司(北京睿博興科生物技術有限公司)進行毛細管電泳，根據(jù)分子量大小確定各個位點的拷貝數(shù)。

1.3.5 聚類分析 統(tǒng)計菌株各個位點的拷貝數(shù)，采用BioNumerics5.10軟件，采用效用均等的分類資料分析方法對各對引物的拷貝數(shù)進行聚類分析。為加強MLVA分型方法中14個低變異度指標在鼠疫種群中的區(qū)分能力，減弱高變異度的12個指標對聚類關系的影響，將第一級分型14個指標的權重設為2，用于種內(nèi)溯源分析的12個指標權重設為1[7]。甘肅省1∶25萬矢量化鎮(zhèn)(鄉(xiāng))地圖由中國疾病預防控制中心提供。采用ArcGIS10.3軟件進行鼠疫菌MLVA類群地區(qū)分布特征分析。

2 結 果

2.1 甘肅省鼠疫菌VNTR拷貝數(shù)結果 “14+12”個VNTR位點在甘肅省鼠疫菌基因組中拷貝數(shù)的結果見表2。與已完成全基因組測序的東方型鼠疫菌株CO92的VNTR位點拷貝數(shù)比較，26個VNTR位點均表現(xiàn)出不同于CO92的拷貝數(shù)。引物M34拷貝數(shù)變化類型最多，為17種，而最少的拷貝數(shù)變化類型為2種，說明26對引物的分辨能力高，能將甘肅省鼠疫菌株分為不同的基因型。

表2 14+12個VNTR位點在甘肅省鼠疫菌株基因組中的拷貝數(shù)變化類型

2.2 甘肅省鼠疫菌MLVA基因型及地區(qū)分布 “14+12”個VNTR位點將198株鼠疫菌分成1-127型，基因分型比較復雜。阿拉善黃鼠疫源地(會寧縣和平川區(qū))MLVA基因型有122、124-127型；甘南高原疫源地(夏河縣)MLVA基因型有39-43型；阿爾金山鼠疫源地(阿克塞縣)MLVA基因型有89-115型；大雪山鼠疫疫源地(肅北縣和玉門市)有44-68型、69-88型、116-119型，祁連山北麓鼠疫源地(肅南縣)MLVA基因型有1-38型。見表3。

表3 甘肅省鼠疫菌MLVA類群及地區(qū)分布

2.3 甘肅省鼠疫菌VNTR聚類圖 采用“14+12”個VNTR位點分析中，將14個低變異度指標權重設為2，另外12個指標權重設為1。聚類結果顯示，198株鼠疫菌分為10個群，對比菌株的分離地點發(fā)現(xiàn)，大部分菌株根據(jù)分離地點聚集成為一群，每個群中菌株可繼續(xù)分為5-28個不同分支。通過聚類圖可以看出，阿拉善黃鼠疫源地菌株全部聚集為一群。阿克塞縣鼠疫菌株主要分為2個群，分別集中在阿克塞縣紅柳灣鎮(zhèn)當金山群(35/47)和加爾烏宗村群(10/47)。肅北縣鼠疫菌主要分為3個群，分別為黨城灣鎮(zhèn)馬場群(6/57)、黨城灣鎮(zhèn)群(25/58)和魚兒紅群(21/57)。玉門市菌株(5/6)主要聚集在肅北縣魚兒紅群內(nèi)。夏河縣菌株單獨成為一群。肅南縣菌株主要分為3個群，分別為大河鄉(xiāng)群(14/73)、馬蹄鄉(xiāng)群(33/73)和康樂鄉(xiāng)群(6/73)。見圖1和圖2。

圖1 198株甘肅省鼠疫菌VNTR位點拷貝數(shù)聚類圖

注：甘肅省1∶25萬矢量化鎮(zhèn)(鄉(xiāng))地圖由中國CDC提供。由于地圖中無法標注加爾烏宗村和馬場村，分別在相應的城鎮(zhèn)地圖中按照村的具體位置選取一定區(qū)域進行標注。

3 討 論

MLVA方法廣泛應用于鼠疫菌基因分型，但是VNTR位點選擇的不同對分子分型和聚類的結果存在一定差別。Pourcel等[8]人選用25個位點將180株鼠疫菌分成61個基因組型，而且3個生物型分別位于3個主要分支上，并發(fā)現(xiàn)中世紀型菌株存在一定的多態(tài)性。Klevytska等[9]采用46個位點對94株鼠疫菌進行分型，正確反映了古典型、中世紀型、東方型和田鼠型菌株之間的進化關系。Li等[4]從88個鼠疫菌VNTR位點篩選出“14+12”個位點用于快速溯源分析，提高了基因分型的分辨率，縮短實驗檢測的時間和成本。本實驗采用的26個位點能夠將生態(tài)型不同的鼠疫菌區(qū)分開，并呈現(xiàn)明顯的區(qū)域聚集性特征。

甘肅省鼠疫菌MLVA基因分型與生態(tài)型能夠很好的吻合，并且基因分型能夠繼續(xù)細分，精確到每個菌株的分離地點。會寧縣和平川區(qū)阿拉善黃鼠疫源地為甘寧黃土高原阿拉善黃鼠疫源地的西南部分，景觀為低山丘陵干草原，菌株為甘寧黃鼠型，菌株獨自成為一群。甘南高原疫源地的夏河縣和祁連山北麓東段區(qū)的肅南縣均為旱獺疫源地，景觀均為森林高山草甸草原。夏河縣菌株為青藏型，肅南縣菌株為祁連型。夏河縣菌株聚集成為一群后，與肅南縣菌株聚集在一起，肅南縣菌株根據(jù)分離地點繼續(xù)分為3個群，每群間菌株沒有明顯的地理屏障，菌株VNTR位點重復數(shù)有細微差別，每個群內(nèi)菌株繼續(xù)分化，表明MLVA分型方法分辨率極高，可用于觀察菌株的微遺傳進化。阿爾金山疫源地的阿克塞縣和大雪山疫源地的肅北縣為旱獺疫源地，景觀類型為高山草原。阿克塞縣菌株主要為阿爾金型，肅北縣菌株主要為青藏型。阿克塞縣菌株分成2個群，是當金山群和祁連山西段分離的菌株聚集成的加爾烏宗村群，兩群菌株之間地理上接壤，沒有明顯的地理屏障。加爾烏宗村群與肅北縣黨城灣鎮(zhèn)馬場群的菌株聚集成為大群，兩地地理上接壤，沒有明顯的地理屏障，屬于祁連山西段，菌株之間交流頻繁，適應相應的地理環(huán)境成為優(yōu)勢菌株。肅北縣的鼠疫菌除馬場群外，還存在黨城灣鎮(zhèn)群和魚兒紅群。黨城灣鎮(zhèn)群和魚兒紅群菌株VNTR位點不同，黨城灣鎮(zhèn)和魚兒紅之間存在大雪山地理屏障，使兩地菌株成為兩個群。玉門市鼠疫疫源地及毗鄰的肅南縣祁豐鄉(xiāng)生境特征與肅北縣魚兒紅相同，且地理位置接壤，屬于同塊疫源地，故菌株都聚集為一群。

甘肅省鼠疫菌遺傳特征復雜，采用MLVA分型方法發(fā)現(xiàn)肅南縣康樂鄉(xiāng)、馬蹄鄉(xiāng)和大河鄉(xiāng)群內(nèi)均含有肅北縣菌株，而肅北縣黨城灣鎮(zhèn)、魚兒紅內(nèi)含有肅南縣菌株，肅北縣黨城灣鎮(zhèn)馬場群內(nèi)含有阿克塞縣菌株。這種群內(nèi)菌株交叉存在的結果與DFR、CRISPR分型方法結果一致[10-12]。不同群內(nèi)菌株的交叉存在，表明阿爾金山-祁連山北麓東段疫源地鼠疫菌基因組之間存在交流，究其原因有待進一步研究。鼠疫菌VNTR位點拷貝數(shù)不斷變化，菌株在自然選擇壓力作用下適應不同生態(tài)景觀成為某地區(qū)的主要基因類群，從而肅北縣和肅南縣疫源地菌株存在主要基因類群和次要基因類群。不同基因類群鼠疫菌的存在表明鼠疫在動物間持續(xù)流行。相對應處于肅北縣與阿克塞縣接壤地區(qū)的馬場，肅北縣和肅南縣接壤地區(qū)的祁豐鄉(xiāng)出現(xiàn)主次基因類群和不同生態(tài)型菌株交叉共存，出現(xiàn)菌株移行重疊現(xiàn)象，更例證了研究中發(fā)現(xiàn)群內(nèi)菌株交叉存在的現(xiàn)象。同種疫源地出現(xiàn)不同類型的鼠疫菌，使得菌株溯源復雜多樣，尤其是在人間鼠疫疫情追蹤溯源時要予以重視。

MLVA 作為一種分子分型方法，其具有高分辨率，可操作性強，費用較低，適合推廣應用。本次采用MLVA(14+12)方法對198株甘肅省鼠疫菌進行基因分型，獲得準確的鼠疫菌VNTR位點拷貝數(shù)本底資料，為今后鼠疫菌株的追蹤溯源提供技術資料，為研究甘肅省鼠疫疫源地鼠疫菌遺傳進化規(guī)律奠定基礎，也為今后開展鼠疫菌遺傳突變的監(jiān)測提供依據(jù)。

利益沖突：無