LC-MS/MS法同時測定人血漿中咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖的濃度*

沈 葉，黃烽如，房秋晨，孫魯寧**，王永慶**

1 徐州醫(yī)科大學 江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，徐州 221004；2 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 臨床藥理研究室，南京210029

細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是人體最重要的藥物代謝酶之一，其主要亞型（CYP3A4/5）參與50%以上臨床用藥的代謝[1，2]。許多外源性物質可以作為誘導劑或抑制劑影響CYP3A底物的體內暴露。因此，確定CYP3A 及其同工酶的活性對于評估藥物相互作用至關重要[3]。目前，評價人體內CYP3A 酶活性的方法主要有探針藥物法[4]（如咪達唑侖、氨苯砜、紅霉素等）和內源性生物標志物法[5，6]。咪達唑侖被我國藥監(jiān)局和美國藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心推薦為CYP3A 酶活性評價的首選探針底物[7]。咪達唑侖（1-甲基-8-氯-6-（2-氟苯基）-4H-咪唑并[l，5-a][l，4]苯并二氮雜艸卓）作為使用最為廣泛的苯二氮唑類短效中樞神經系統(tǒng)抑制劑，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、肌肉松弛的作用[8]。咪達唑侖作為探針藥物進入人體后經CYP3A 代謝生成主要代謝物1-羥基咪達唑侖[9]。

目前，文獻報道測定人血漿中咪達唑侖的分析方法主要為高效液相色譜法[10，11]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[8，12～14]。然而，文獻[10，11]中建立的方法靈敏度較低，分析時間較長。文獻[13，14]開發(fā)的方法前處理復雜，需要萃取或者旋干的操作，分析時間較長?，F(xiàn)建立了一種前處理簡單快捷、線性范圍寬、高效靈敏的同時測定人血漿中咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖的HPLC-MS/MS 法，可應用于咪達唑侖作為CYP3A 探針的臨床藥物相互作用的研究。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

1290 Infinity 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），包括G4220A 二元高壓泵；G1316C 柱溫箱和G4226A 多孔板自動進樣器；API 4000 三重四極桿質譜儀，配備電噴霧離子源，Analyst1.6.3 數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)（美國應用生物公司）；BP211D 電子天平（德國Sartorius 公司）；Mixmate 渦旋混勻儀（德國Eppendorf 公司）；Stratos 離心機（德國Thermo Fisher 公司）。

1.2 藥品與試劑

馬來酸咪達唑侖（中國食品藥品檢定研究院，批號：E1822047，純度：100.0%）；1-羥基咪達唑侖溶液（美國Cerilliant 公司，批號：FN12081503，濃度：100 μg·mL-1，溶劑：甲醇）；d4-咪達唑侖溶液（美國Cerilliant 公司，批號：FE03311701，濃度：100 μg·mL-1，溶劑：甲醇）；乙腈為色譜純（美國Merck 公司）；超純水（18.2 MΩ）由Millipore 純水儀制得。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex C18（2.1mm×50mm，2.6μm）；柱溫：38℃；流動相由1mmol·L-1甲酸銨溶液（含0.1%甲酸）（A 相）和乙腈（B 相）組成，梯度洗脫程序見表1；流速：0.3mL·min-1；進樣量：3.0μL；分析時間7min。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質譜條件

采用多重反應監(jiān)測（MRM）離子檢測方式，離子化方式：電噴霧離子化（ESI），在正離子模式下進行掃描檢測，離子化電壓為4500 V，溫度設為600 ℃，霧化氣壓力為60 psi，渦輪氣壓力為60 psi，氣簾氣壓力為50 psi，碰撞氣壓力為10 psi。咪達唑侖、1-羥基咪達唑侖及d4-咪達唑侖的定量離子對，去簇電壓（DP），射入電壓（EP），碰撞能量（CE），碰撞室射出電壓（CXP）見表2。

表2 質譜條件

2.3 儲備液和工作液的配制

精密稱取馬來酸咪達唑侖對照品13.55 mg（經純度換算相當于咪達唑侖10.00 mg），用甲醇溶解定容至10.0 mL 量瓶中，得到1.00 mg·mL-1的咪達唑侖儲備液。取咪達唑侖儲備液40 μL 以及100 μg·mL-1的1-羥基咪達唑侖儲備液200 μL 置于同一2.0 mL 量瓶中，并用甲醇定容，得到咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖濃度分別為20.0/10.0 μg·mL-1的混合工作液，將此混合工作液用甲醇逐級稀釋，得到咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖濃度分別為6.00/3.00、8.00/4.00、80.0/40.0、400/200、1200/600、2000/1000、3200/1600、4000/2000 ng·mL-1的系列濃度標準曲線用混合工作液，以及濃度分別為16.0/8.00、1000/500、3600/1800 ng·mL-1的質控用混合工作液。

以乙腈為溶劑，配制含d4-咪達唑侖濃度為15.0 ng·mL-1的內標工作液。

2.4 標準曲線和質控樣本的配制

采用空白血漿配制標準曲線和質控樣本。取50 μL 空白血漿，加入2.50 μL 相應濃度的混合工作液，配成含咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖濃度分別為0.300/0.150、0.400/0.200、4.00/2.00、20.0/10.0、60.0/30.0、100/50.0、160/80.0、200/100 ng·mL-1的混合標準曲線樣本，以及咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖濃度分別為0.800/0.400 ng·mL-1、50.0/25.0 ng·mL-1和180/90.0 ng·mL-1的混合質控樣本。

2.5 樣本前處理

取50 μL 血漿樣本，加入150 μL 含d4-咪達唑侖的乙腈工作液，置1.5 mL 離心管中，渦旋10 min，16000 r·min-1離心15 min（4 ℃），取上清液進樣作LC-MS/MS 分析。

2.6 專屬性考察

本實驗分別考察了咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖及d4-咪達唑侖在人血漿中的專屬性。咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖及d4-咪達唑侖的保留時間分別約為2.3 min、1.9 min 和2.3 min。典型色譜圖見圖1。結果表明，血漿中咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖及d4-咪達唑侖峰位處無干擾。

圖1 咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖及d4-咪達唑侖在血漿中的色譜圖

2.7 標準曲線

按“2.4”項方法制備混合標準曲線樣本和混合質控樣本。按“2.5”項下方法處理樣本。以濃度（C）為橫坐標，以待測化合物/內標峰面積比值（f）為縱坐標，用權重系數(shù)1/C2進行最小二乘法作線性回歸。典型的咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖標準曲線方程分別為：

結果表明，分別在0.300～200 ng·mL-1與0.150～100 ng·mL-1線性關系良好。

2.8 提取回收率

按“2.4”項下方法，使用6 個不同來源的空白血漿制備低濃度（咪達唑侖/1-羥基咪達唑侖，0.800/0.400 ng·mL-1）、中濃度（咪達唑侖/1-羥基咪達唑侖，50.0/25.0 ng·mL-1）、高濃度（咪達唑侖/1-羥基咪達唑侖，180/90.0 ng·mL-1）混合質控樣本，按“2.5”項下方法處理。同時在6 個不同來源的空白血漿的乙腈提取液加入相同濃度的咪達唑侖、1-羥基咪達唑侖和d4-咪達唑侖工作液，渦旋混勻。上述每個濃度樣本各配制3 份，進樣分析后，以空白血漿制備的樣本中分析物的峰面積與空白血漿的乙腈提取液制備的樣本中分析物的峰面積的比值，評價提取回收率。結果顯示，3 種濃度血漿樣本中咪達唑侖的提取回收率分別為（101.6±6.6）%、（102.2±2.9）%、（100.6±6.8）%；1-羥基咪達唑侖的提取回收率為（101.8±4.6）%、（102.4±3.2）%、（101.1±7.1）%。

2.9 基質效應

按“2.4”和“2.5”項下方法，使用6 個不同來源的空白血漿制備乙腈提取液，加入待測咪達唑侖、1-羥基咪達唑侖和d4-咪達唑侖工作液，制備低濃度（咪達唑侖/1-羥基咪達唑侖，0.800/0.400 ng·mL-1）和高濃度（咪達唑侖/1-羥基咪達唑侖，180/90.0 ng·mL-1）質控的基質效應樣本；同時用水基質制備相同的低濃度和高濃度樣本；將上述樣本進樣分析，得到各樣本待測化合物與內標的峰面積，計算待測化合物/內標峰面積比值（f），用于評價血漿基質對分析的影響。

在低濃度和高濃度血漿樣本中，咪達唑侖的基質效應分別是（101.4±4.3）%、（98.9±2.7）%，1-羥基咪達唑侖的基質效應分別是（99.1±3.0）%、（95.5±2.9）%，結果顯示，血漿基質不影響樣本檢測。

2.10 準確度和精密度試驗

按“2.4”項下方法，配制定量下限樣本，低、中、高3 種濃度的血漿基質混合質控樣本，每個濃度配制5 份（n=5），按“2.5”項下方法處理，考察批內和批間準確度和精密度。結果見表3。

表3 精密度和準確度試驗結果（n=5）

2.11 穩(wěn)定性試驗

按“2.4”項下方法，配制濃度為低、高兩種濃度的血漿基質混合質控樣本，分別在室溫（24 ℃）放置12 h、自動進樣器（10 ℃）中放置24 h、3 次凍融循環(huán)、-40 ℃冰凍10 個月，按“2.5”項下方法處理，以準確度評估穩(wěn)定性。結果顯示，待測化合物在上述各條件下穩(wěn)定性均良好。見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結果

3 人血漿中咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖濃度的測定

評價促變藥物對馬來酸咪達唑侖片在健康受試者中的藥代動力學影響研究（預試驗），在南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗室完成。在第一周期研究中，6 例健康男性受試者于試驗第1 天早上空腹口服15 mg 馬來酸咪達唑侖片（1 片），分別于給藥前0 h（給藥前1.0 h 內）和給藥后10、20、30、45 min，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、8.0、12、14、24 h（共16 個時間點），采集上肢靜脈血4 mL，分離血漿后保存于-80°C 冰箱待用。使用建立的LC-MS/MS 法對上述血樣進行濃度測定。6 例健康男性受試者咪達唑侖及1-羥基咪達唑侖血藥濃度均值-時間曲線見圖2。

圖2 健康男性受試者咪達唑侖及1-羥基咪達唑侖血藥濃度均值-時間曲線（n=6）

4 討論

本研究建立并驗證了同時測定人血漿中咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖的HPLC-MS/MS 法。在方法開發(fā)過程中，對每項質譜參數(shù)進行了優(yōu)化，使得兩個待測化合物均具現(xiàn)有條件下最高的質譜響應。

在優(yōu)化色譜條件時，考察了用乙腈和甲醇作為有機相的方法，發(fā)現(xiàn)兩種有機試劑對于峰型和響應的影響相差無幾；但考慮到乙腈沉淀蛋白效果更佳，因此在有機相的選擇上最終確定為乙腈。除此之外還評價了1 mmol·L-1乙酸銨和1 mmol·L-1乙酸銨（含0.1%甲酸）作為水相的方法，研究發(fā)現(xiàn)，甲酸的加入會大大減輕殘留效應，因此最終選擇乙腈-1 mmol·L-1甲酸銨（含0.1%甲酸）作為流動相。流速設置為0.3 mL·min-1可以同時兼顧分析時間和色譜柱壓力，并且具有良好的分離效果。同時建立了梯度洗脫程序，在實現(xiàn)良好的色譜分離的同時，在待測化合物出峰后使用95%有機相沖洗1.8 min 以保護色譜柱和減少本次進樣對下一次進樣的影響，以提高方法的耐用性。

本方法僅需50 μL 的樣本量，樣品制備程序基于一個簡單的蛋白質沉淀步驟，避免了復雜的萃取過程，靈敏度較高，且分析時間較短。最終建立了同時測定人血漿中咪達唑侖和1-羥基咪達唑侖濃度的HPLC-MS/MS 法，可用臨床藥物相互作用研究。