陳 俊 方遠(yuǎn)鵬 杜巧麗 蔣君梅任明見 李向陽 田山君 謝 鑫,

(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，貴陽 550025)(國家小麥改良中心貴州分中心2，貴陽 550025)(貴州大學(xué)綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，貴陽 550025)

高粱(Sorghumbicolor)是我國主要的雜糧作物之一，屬于C4植物，具有光合作用效率高、抗旱性強(qiáng)等特點(diǎn)[1-3]。同時(shí)，高粱作為白酒原材料具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。白酒是貴州省重要的支柱產(chǎn)業(yè)，白酒行業(yè)的發(fā)展帶動(dòng)了貴州省的高粱種植，其種植面積在貴州省逐年擴(kuò)大，使得高粱連作現(xiàn)象較為普遍，由于病原的初始菌量積累和氣候變化等因素，致使其病害危害程度逐年上升，病害危害面積逐年擴(kuò)大。

病原菌侵染植物時(shí)會觸發(fā)植物體內(nèi)一系列的抗病反應(yīng)[4]，即誘導(dǎo)植物防御體系激發(fā)抗病基因的表達(dá)來應(yīng)對病原菌的侵入。而過敏性誘導(dǎo)反應(yīng)是眾多植物抗病反應(yīng)中最為常見的類型，常表現(xiàn)為病原菌侵染點(diǎn)附近的細(xì)胞組織壞死，阻止病菌的擴(kuò)展和生長，誘發(fā)植物抗病反應(yīng)[5]。過敏性誘導(dǎo)反應(yīng)(Hypersensitive-induced reaction，HIR)基因家族是一類與植物HR相聯(lián)系的基因家族，隸屬PID(proliferation, ion and death，PID)家族，含有SPFH (stomatins, prohibitins, flotillins and HflK/C) 結(jié)構(gòu)域[6,7]。Karrer等[8]最早在煙草中發(fā)現(xiàn)一種能夠誘導(dǎo)β-葡萄糖苷酶的表達(dá)及植物葉片細(xì)胞壞死的蛋白NG1。隨后，在玉米、大麥、水稻和辣椒等植物中HIR基因相繼被報(bào)道[9-12]。HIR基因家族成員在植物抗病反應(yīng)中承擔(dān)著重要的角色。研究表明，CaHIR1基因是過敏性細(xì)胞壞死的正向調(diào)控因子，并且能夠參與滲透脅迫的反應(yīng)[13]。同時(shí)，HIR基因也能夠參與單子葉和雙子葉植物的抗病功能和HR反應(yīng)[7]。目前，HIR基因家族在多種經(jīng)濟(jì)作物上已有研究，但在旱糧作物高粱上的影響鮮有報(bào)道。

本研究在全基因組的水平上對高粱HIR基因家族成員進(jìn)行鑒定，并分析其成員的基本理化性質(zhì)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、以及所編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。同時(shí)，利用qRT-PCR技術(shù)分析高粱HIR基因家族成員的組織特異性，脫落酸(Abscisic acid，ABA)、赤霉素(Gibberellin A3，GA3)和flg22脅迫時(shí)對其表達(dá)量的影響，以期為進(jìn)一步挖掘高粱HIR基因家族成員在植物信號通路、調(diào)控植物HR反應(yīng)等方面的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

高粱品種：BTx623。脫落酸；赤霉素；flg22；SYBR熒光染料試劑盒；TRIzol；反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

CFX96TMoptics module實(shí)時(shí)熒光定量分析儀，NanoDrop one微量核酸蛋白濃度測定儀，Centrifuge 5427 R低溫離心機(jī)。

引物采用Primer Premier 5軟件和qPrimerDB數(shù)據(jù)庫相結(jié)合進(jìn)行設(shè)計(jì)，選用SbEIF4a作為高粱的內(nèi)參基因，引物序列如表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 高粱HIR基因家族鑒定、染色體定位和理化性質(zhì)分析

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載擬南芥、水稻、玉米、大麥、小麥和辣椒HIR家族成員的氨基酸序列，運(yùn)用Hmmer程序建立模型，檢索高粱數(shù)據(jù)庫，選取E值小于0.05的高粱基因序列；結(jié)合NCBI-CD結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證E值小于0.05的高粱基因序列的結(jié)構(gòu)域；在phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)數(shù)據(jù)庫中查詢高粱第2、3、7、9和10號染色體的全長，及高粱HIR家族成員所在染色體數(shù)和位置區(qū)間；利用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)在線網(wǎng)站繪制高粱HIR基因家族染色體分布情況；利用在線網(wǎng)站ExPASy-Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)分析高粱HIR家族成員的基本理化性質(zhì)[3]；使用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在線網(wǎng)站預(yù)測高粱HIR家族成員的亞細(xì)胞定位。

1.2.2 高粱HIR家族成員系統(tǒng)發(fā)育分析

為研究高粱HIR家族成員的進(jìn)化模式，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥、水稻、玉米、大麥、小麥和辣椒的HIR蛋白序列；利用MEGA7.0，以鄰接法，bootstrap值設(shè)置為1 000[14]，構(gòu)建高粱與這些物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用Figtree軟件對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行美化。

1.2.3HIR家族基因密碼子偏好分析

利用在線工具Chips(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/chips)和Cusp(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/cusp)在線網(wǎng)站分析擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱家族基因密碼子的偏好性。

1.2.4 高粱HIR家族基因結(jié)構(gòu)和HIR家族成員保守基序分析

研究高粱HIR家族基因結(jié)構(gòu)分布情況，及擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱HIR家族成員的功能完整性，對高粱HIR家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序(Conserved motif，Motif)進(jìn)行分析。使用GSDS2(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線工具對高粱HIR家族基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用MEME(http://meme-suite.org/)在線網(wǎng)站(參數(shù)：篩選數(shù)量為10，E-value

1.2.5 高粱HIR蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

使用在線網(wǎng)站NPSA-PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html)，對高粱HIR蛋白二級結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行預(yù)測。

1.2.6 高粱種植和樣品處理

選擇健康高粱種子在清水中浸種24 h，隨后用濾紙保濕48 h進(jìn)行催芽，將發(fā)芽的種子播種在滅菌營養(yǎng)土中，在25 ℃、光照12 h/黑暗12 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到3葉期，取高粱幼苗的根、莖、葉，于-80 ℃保存?zhèn)溆?；另一方面將高粱幼苗的根部浸泡在分別含有ABA、GA3和flg22的營養(yǎng)液中，其處理濃度分別為200 μmol/L、100 μmol/L、100 nmol/L，然后分別在處理后0、0.5、1、3、6、9、12、24 h取樣，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)處理5株，所取樣品用液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 高粱HIR基因表達(dá)分析

采用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行分析，利用qRT-PCR檢測高粱SbHIR1～SbHIR5基因的表達(dá)量，其反應(yīng)體系為：cDNA 4.5 μL，SYBR Premix 7.5 μL，SbHIRs基因的上下游引物各 0.3 μL，ddH2O補(bǔ)足15 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，1個(gè)循環(huán)；設(shè)置 3 個(gè)技術(shù)性重復(fù)，其數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析，利用DPS軟件進(jìn)行顯著性分析，其qRT-PCR引物如表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱HIR基因家族的鑒定和基本理化性質(zhì)分析

為研究HIR家族基因在高粱中所存在的成員數(shù)，利用Hmmer軟件進(jìn)行篩選。由表2和圖1可知，在高粱中鑒定出5個(gè)HIR基因，根據(jù)所在高粱染色體中的位置命名為SbHIR1～SbHIR5；分別處于第2、3、7、9、10號染色體上；SbHIR1、SbHIR2、SbHIR4和SbHIR5基因所編碼的氨基酸數(shù)量、相對分子質(zhì)量大小和理論等電點(diǎn)較為接近，而SbHIR3與其他家族成員的氨基酸序列長度和蛋白分子量大小差異較大分別為413 aa、45.02 ku；高粱HIR家族蛋白均為親水性蛋白；亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示均定位于線粒體中。

圖1 高粱HIR基因在染色體上的分布

表2 SbHIRs基因編碼蛋白的基本特征

2.2 高粱HIR家族系統(tǒng)發(fā)育分析

構(gòu)建擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱的HIR家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖2可知，該進(jìn)化樹一級分支分為兩支，在二級樹分支內(nèi)雙子葉植物(擬南芥、辣椒)HIR家族成員明顯區(qū)分于其他幾種單子葉植物(水稻、玉米、小麥、大麥和高粱)，早熟禾亞科(小麥、大麥)、稻亞科(水稻)和黍亞科(高粱、玉米)的HIR成員明顯分開，各自在不同的分支中，而早熟禾亞科與黍亞科HIR成員形成姐妹基因?qū)Γ幌鄬μ厥獾氖?，在同一支?nèi)，SbHIR2明顯與其他單子葉HIR成員形成較大的差異(支持率為100%)，單獨(dú)形成一個(gè)特有支；高粱HIR成員與玉米HIR家族成員的親緣關(guān)系較近。

圖2 擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱HIR成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3 HIR家族基因密碼子偏好分析

由表3可知，不同物種間及物種內(nèi)HIR基因的密碼子選擇性較為保守，有效密碼子數(shù)在33.243～58.430之間，而SbHIR2的有效密碼子數(shù)僅為33.243，說明密碼子偏好較強(qiáng)；單子葉植物(水稻、玉米、小麥、大麥和高粱)大部分HIR基因GC和GC3s的含量大于50.00%，即水稻、玉米、小麥、大麥和高粱的HIR基因編碼區(qū)對堿基的選擇更偏向于G+C，且密碼子偏好于以G/C結(jié)尾，且該情況在高粱SbHIR2上較為明顯。而雙子葉植物(擬南芥、辣椒)HIR基因GC和GC3s的含量均小于50.00%，對堿基G+C和密碼子G/C結(jié)尾的偏好性較弱。不同物種間及物種內(nèi)HIR基因的有效密碼字?jǐn)?shù)相對保守，單子葉和雙子葉植物HIR基因的堿基偏好及密碼子的結(jié)尾的偏好有所不同。

表3 擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱HIR基因的密碼子偏好分析

2.4 高粱HIR家族基因結(jié)構(gòu)和HIR家族蛋白的Motif分析

由圖3a可知，高粱HIR基因內(nèi)含子數(shù)為1～6個(gè)，基因結(jié)構(gòu)相對簡單，僅有SbHIR3基因缺乏上游UTR。由圖3b可知，擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱的HIR基因Motif均相對保守，具備9個(gè)Motif(OsHIR2和SbHIR2除外)，而OsHIR2和SbHIR2均出現(xiàn)Motif 8的缺失，同時(shí)，SbHIR2也缺失Motif 5。

2.5 高粱HIR蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

由表4可知，SbHIR1～SbHIR5二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主，其次是無規(guī)卷曲、延伸鏈，β-轉(zhuǎn)角占比最低。

表4 高粱HIR蛋白二級結(jié)構(gòu)組份

2.6 高粱HIR基因表達(dá)分析

研究高粱HIR基因家族的組織特異性表達(dá)和在植物激素(ABA和GA3)和flg22脅迫處理下的表達(dá)量。通過qRT-PCR分析可知，SbHIR1基因在莖中的表達(dá)量約為根和葉的4倍；SbHIR2基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但在根中表達(dá)量最高；SbHIR3、SbHIR4和SbHIR5基因均在葉中表達(dá)量最高(圖4)。

圖4 高粱HIR基因家族成員組織表達(dá)分析

在植物激素ABA處理后，高粱HIR基因家族各個(gè)成員的表達(dá)模式不同，SbHIR1和SbHIR5的表達(dá)量在12 h時(shí)達(dá)到最高；SbHIR2和SbHIR3基因在0.5 h時(shí)表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量降低；SbHIR4基因在6 h時(shí)表達(dá)量最高(圖5)。

在植物激素GA3處理下，高粱SbHIR1基因的表達(dá)量呈先降后升的趨勢，在3 h時(shí)表達(dá)量最低，然后又逐漸上升，在12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高；SbHIR2和SbHIR3基因在GA3處理下，其表達(dá)均受到一定程度的抑制；SbHIR4和SbHIR5基因在GA3處理下均在6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高(圖6)。

注： Motif 1～9分別用數(shù)字1～9表示。圖3 高粱HIR的基因結(jié)構(gòu)和擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱HIR蛋白保守基序分析

圖5高粱HIR基因家族成員ABA處理的表達(dá)分析

圖6高粱HIR基因家族成員GA3處理的表達(dá)分析

在flg22脅迫處理下，SbHIR1的表達(dá)量呈現(xiàn)出下降-上升-下降-上升的趨勢，在9 h達(dá)到最高；SbHIR2和SbHIR4，均在12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高；而SbHIR3在各時(shí)間段內(nèi)表達(dá)量均有一定程度的變化，但12 h時(shí)表達(dá)量最低；SbHIR5的表達(dá)量呈現(xiàn)出下降-上升-下降的趨勢，在9 h達(dá)到最高(圖7)。

圖7高粱HIR基因家族成員flg22處理的表達(dá)分析

3 結(jié)論

利用生物信息學(xué)方法和qRT-PCR技術(shù)在全基因組水平上對高粱HIR基因家族進(jìn)行鑒定，共鑒定得到5個(gè)成員；5個(gè)成員之間的理化性質(zhì)具有差異，且均為親水性蛋白；系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)高粱HIR基因與玉米的親緣關(guān)系較近；密碼子偏好分析表明，高粱的HIR基因編碼區(qū)對堿基的選擇更偏向于G+C，且密碼子偏好于以G/C結(jié)尾；高粱HIR基因家族成員的二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主；高粱HIR基因家族成員在根、莖和葉中均能夠表達(dá)，且在植物激素(ABA和GA3)的處理下，其在高粱葉片中的表達(dá)量均出現(xiàn)了不同程度的變化，當(dāng)flg22脅迫處理時(shí)其高粱HIR基因家族成員的表達(dá)量變化趨勢較為明顯。