張月江 張新永 李艷嬌 邢江艷 林 奇 包媛媛

(云南農(nóng)業(yè)大學，昆明 650000)

美藤果(Sacha Inchi)又名印加果、南美油藤、星油果等，是一種大戟科木質(zhì)藤本植物[1，2]。美藤果原產(chǎn)中美洲、南美洲和東南亞等地區(qū)[3]，目前已大面積引種云南西雙版納、紅河等地區(qū)[4]。2013年美藤果油被衛(wèi)生部正式批準為新資源食品[5]，其是以美藤果種籽為原料, 經(jīng)脫殼、粉碎、壓榨、過濾等工藝制成的淡黃色透明油狀液體。Páucar等[6]采用酸敗法對美藤果油貨架期評價，在20 ℃時美藤果油貨架期可達到3.29年。薛莉等[7]報道美藤果油中甾醇含量高于其他常見植物油，讓美藤果油具有較強的氧化穩(wěn)定性。

以核桃為原料加工的天然核桃油脂，在市場上備受消費者青睞[8]，然而目前核桃油加工產(chǎn)業(yè)核心是核桃油穩(wěn)定性問題[9，10]。為解決核桃油氧化問題，添加抗氧化劑，然而常用抗氧化劑TBHQ會對動物有致突變，BHA和BHT有致癌[11]。核桃油中甾醇含量為β-谷甾醇(75.10±19.26) mg/100 g；豆甾醇(17.49±9.34) mg/100 g[12]。有報道甾醇是植物油本身天然抗氧化成分[13]，能有效延緩脂質(zhì)過氧化反應，抑制油脂酸值和過氧化值升高[14]，高瑀瓏等[15]發(fā)現(xiàn)甾醇在大豆油中具有抗氧化作用且存在顯著的量效關系；黃瀅璋等[14]結果顯示甾醇抗氧化作用明顯優(yōu)于 BHT 和 VC。李昌璞等[16]研究發(fā)現(xiàn)玉米油中甾醇濃度與羥自由基清除作用強度有明顯量效關系。

本研究測定美藤果油中甾醇，初步探明美藤果油和核桃油甾醇不同，按美藤果油甾醇比例添加甾醇于核桃油中，以添加維生素E、檸檬酸、BHA、TBHQ的核桃油為對照組，采用 Schaal 烘箱法，研究美藤果油甾醇對核桃油氧化穩(wěn)定性的影響，確定油脂中甾醇抗氧化作用以及其與天然抗氧化劑(維生素E、檸檬酸)協(xié)同增效作用，為研究天然復配抗氧化劑以及核桃油等油脂保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美藤果仁：云南普洱；核桃：大理漾濞；豆甾醇和β-谷甾醇標準品(純度≥98%)；甲醇、叔丁基甲醚：色譜純；TBHQ、維生素E、BHA、檸檬酸均為食品添加劑。

1.2 儀器與設備

ThermoUltimate3 000高效液相色譜儀，RG-306游俠榨油機。

1.3 方法

1.3.1 美藤果油制備

美藤果果仁脫殼備用。準確取備用美藤果果仁5 kg，采用螺旋冷榨機壓榨，離心過濾(3 500 r/min,10 min)處理美藤果毛油釋出沉淀物，收集離心后的油液澄清無雜質(zhì)呈淡黃色。

1.3.2 美藤果油中甾醇提取

參照高政等[17]、趙茜茜等[18]的方法。稱混勻的美藤果毛油10 g(精確至0.01 g)，加入1 mol/L的氫氧化鈉-乙醇溶液，加入適量沸石；水浴鍋溫度為85 ℃，冷凝回流煮沸1 h，用燒杯取適量蒸餾水，取幾滴皂化液滴入蒸餾水中，看滴入的皂化液是否完全溶解沒有油質(zhì)，若完全溶解則說明皂化完全。皂化完全后減壓蒸餾回收乙醇；加蒸餾水稀釋，取出沸石，冷卻皂化液備用。將乙醚加入皂化液，置于分液漏斗充分接觸，靜置分層，多次萃取，合并上層乙醚萃取液，依次用蒸餾水、氫氧化鈉水溶液、蒸餾水洗滌，最后至乙醚溶液呈中性；再將乙醚溶液用無水硫酸鈉多次過濾，減壓蒸餾回收揮干乙醚，即得到美藤果油甾醇粉末粗提物。

1.3.3 美藤果油中甾醇的測定1.3.3.1 色譜條件

色譜柱為Syncronis-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相∶甲醇；波長∶205 nm；柱溫∶30 ℃；進樣量∶10 μL；流速: 1 mL/min。

1.3.3.2 標準品溶液配制

分別精確稱取標準品豆甾醇、β-谷甾醇10 mg置于燒杯中，加叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)溶液溶解定容于5 mL容量瓶，即得濃度分別為2 mg/mL的豆甾醇和β-谷甾醇標準品儲備液，混合得到濃度分別為1 mg/mL豆甾醇和β-谷甾醇，即混合標準品儲備液。

1.3.3.3 標準曲線繪制

精確稱取甾醇混合標準品儲備液，加叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)稀釋，豆甾醇和β-谷甾醇濃度分別為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL混合線性標準品，搖勻溶液過0.22 μm微孔濾膜，置于樣品瓶，以濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y) 繪制標準曲線。

1.3.3.4 樣品溶液配制

取10 g美藤果油經(jīng)1.3.2提取得到甾醇粗提物0.10 g(精確至0.01 g)，置于10 mL的燒杯中，加入叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)溶液溶解，定容于10 mL容量瓶，搖勻溶液過0.22 μm微孔濾膜，置于樣品瓶。

1.3.3.5 樣品含量測定

將1.3.3.4樣品溶液重復進樣，通過混合甾醇標準品進行美藤果油甾醇定性，計算其峰面積平均值，用外標法計算美藤果油甾醇含量。

1.3.4 甾醇對核桃油氧化穩(wěn)定性的影響

核桃油預處理：同前1.3.1步驟處理得到澄清現(xiàn)榨核桃油；將甾醇標準品按β-谷甾醇和豆甾醇比例為2∶1混勻備用。

參考田雨等[19]的方法。采用Schaal烘箱法,添加甾醇、用維生素E、TBHQ、BHA、檸檬酸作為對照，根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》，添加量分別設置為100、150、200 mg/kg的核桃油樣；同時不添加核桃油作為空白。將所有核桃油樣于25 ℃超聲處理10 min溶解混勻，放置溫度為(60±1) ℃的恒溫干燥箱，加快氧化，每隔12 h充分振蕩混勻，并交換油樣位置，每48 h測定核桃油的過氧化值和酸值。酸值按GB 5009.229—2016中指示劑滴定法；過氧化值按GB 5009.227—2016中滴定法。

1.3.5 復配甾醇抗氧化劑對核桃油抗氧化效果

將甾醇、維生素E和檸檬酸復配作為天然抗氧化劑添加到核桃油中，以過氧化值為響應值，采用BOX-Behnken設計響應面實驗方案，根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》，將甾醇、維生素E、檸檬酸添加量設為200 mg/kg。按方案添加核桃油樣，通過恒溫干燥箱溫度為(60±1) ℃加速氧化10 d，測定所有核桃油樣的過氧化值。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均為至少3次測定的平均值，并計算標準偏差；相關性分析采用SPSS17.0 數(shù)據(jù)處理軟件，差異顯著(P<0.05)。

表1 響應面實驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 美藤果油中甾醇含量研究結果

2.1.1 美藤果油甾醇標準曲線的確定

根據(jù)圖1叔丁基甲醇(1∶4)溶液HPLC色譜圖與圖2混合甾醇標品(1 mg/mL豆甾醇和1 mg/mLβ-谷甾醇)HPLC色譜圖，結果顯示，空白叔丁基甲醇溶液與混合甾醇標品，在同一保留時間無色譜峰，說明空白叔丁基甲醇(1∶4)溶液對美藤果油甾醇的含量測定無干擾。

圖1 叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)溶液的HPLC色譜圖

混合甾醇標品色譜圖(圖2)分析得知，豆甾醇標品出峰時間約在24 min左右，β-谷甾醇標品出峰時間約在28 min左右，分離較完整且峰形較好。根據(jù)豆甾醇和β-谷甾醇標品峰面積分別與濃度的關系建立標準曲線，得出在0.1～1 mg/mL范圍內(nèi)，線性回歸方程：豆甾醇Y=97.809x-0.807 1，R2為0.999；β-谷甾醇Y=69.442x-0.111 2，R2為0.999。

圖2 混合甾醇標品為1 mg/mL豆甾醇和1 mg/ml谷甾醇的HPLC色譜圖

2.1.2 精密度結果

混合甾醇標準品樣品(豆甾醇和β-谷甾醇質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL)經(jīng)HPLC測定，得到峰面積結果(表2)，計算得知豆甾醇標準品RSD為0.28%，β-谷甾醇標準品RSD為0.70%，說明儀器精密度良好。

表2 精密度實驗結果

2.1.3 加標回收率結果

美藤果油甾醇加標樣品經(jīng)HPLC測定，得到峰面積結果(表3、表4)，計算得知豆甾醇平均回收率為102.1%，RSD為0.71%；β-谷甾醇平均回收率為103.9%，RSD為0.56%；說明檢測結果準確可靠。

表3 美藤果油樣豆甾醇加標回收率結果

表4 美藤果油樣谷甾醇加標回收率

2.1.4 美藤果油甾醇含量的確定

美藤果油甾醇粗提物樣品HPLC色譜圖(圖3)，可知β-谷甾醇和豆甾醇是美藤果油甾醇的主要成分。美藤果油甾醇粗提物樣品的豆甾醇出峰時間約在24.5 min左右；β-谷甾醇出峰時間約在28.2 min左右；與甾醇混合標品相比，出峰時間較相近，峰形變化不大，只是峰面積有所變化；計算美藤果油甾醇粗提物樣品溶液的峰面積，其中豆甾醇峰面積為(66.430 1±0.45) mAU·min，β-谷甾醇峰面積為(108.542 5±0.32) mAU·min，得美藤果油中豆甾醇含量為(68.743 4±0.46) mg/100 g，β-谷甾醇含量為(156.466 8±0.46) mg/100 g。

圖3 美藤果油甾醇粗提取物為0.1 g/10 mL樣品的HPLC色譜圖

2.2 甾醇對核桃油氧化穩(wěn)定性影響結果

2.2.1 過氧化值的分析

隨貯藏時間增加，核桃油樣氧化酸敗加大，核桃油樣品過氧化值的量為1 kg核桃油樣品中活性氧的毫摩爾數(shù)，過氧化值增大，說明核桃油被氧化程度加深。

2.2.1.1 不同添加量甾醇對核桃油過氧化值結果

由表5可看出，在核桃油中添加100、150、200 mg/kg甾醇，通過恒溫干燥箱溫度為(60±1)℃加速氧化12 d后，相當于常溫20 ℃保存192 d,其中未添加甾醇的空白核桃油過氧化值增長最高為(56.43±5.17) mmol/kg。

表5 不同添加量的甾醇對核桃油過氧化值的影響

添加量100～200 mg/kg甾醇與空白核桃油過氧化值分析：第0～6天，過氧化值差異不顯著(P>0.05)；第6～10天，過氧化值差異顯著(P<0.05)；第12天，過氧化值差異不顯著；添加量200 mg/kg甾醇與空白核桃油過氧化值分析：第0～4天，過氧化值差異不顯著；第6～12天，過氧化值差異顯著；根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》，甾醇最佳添加量為200 mg/kg。

濃度為100～200 mg/kg甾醇對核桃油其抗氧化作用隨著甾醇添加量的增大而增強；甾醇化合物對核桃油具有抗氧化作用的原因可能是因為甾醇通過直接與氧化產(chǎn)生的自由基反應，抑制脂質(zhì)過氧化物的生成，以達到抗氧化作用[20]。

2.2.1.2 甾醇與不同抗氧化劑對核桃油過氧化值結果

從表6可看出，在添加量200 mg/kg的條件下，加速氧化后，未添加抗氧化劑的核桃油過氧化值增長最高；5種抗氧化劑對核桃油12 d后過氧化值高低依次為: TBHQ

表6 甾醇與不同抗氧化劑對核桃油過氧化值的影響/mmol/kg

添加甾醇和空白核桃油樣過氧化值分析：第0～4天，差異不顯著；經(jīng)過4 d的引發(fā)誘導期，在第4～12天，差異顯著(P<0.05)；說明甾醇能延緩核桃油氧化?？赡苁怯捎诤颂矣椭戌薮己枯^低，添加甾醇是脂溶性抗氧化劑并且補充核桃油甾醇內(nèi)源性抗氧化成分含量，發(fā)揮其抗氧化能力。

添加甾醇和檸檬酸核桃油樣過氧化值分析：第0天，差異不顯著；第2天，添加檸檬酸比空白過氧化值高且差異顯著，但甾醇和空白差異不顯著，可能是由于核桃油自身抗氧化物質(zhì)存在，添加檸檬酸反而起到促氧化情況，此時甾醇并未出現(xiàn)促氧化情況；第4～12天，差異顯著，說明甾醇比檸檬酸抗氧化效果好； 添加甾醇和維生素E核桃油油樣過氧化值分析：第0天，差異不顯著；第2～12天，差異顯著；說明維生素E在核桃油中未能發(fā)揮較好抗氧化能力，甾醇抗氧化能力較好；趙雁武等[21]研究以β-谷甾醇為主蘋果籽油甾醇與維生素E對自由基清除能力，表明甾醇清除自由基的能力較維生素E高，本實驗與此結果一致。

添加甾醇和TBHQ、BHA核桃油樣，第0～12天，差異顯著，說明添加甾醇抗氧化能力不如TBHQ和BHA；劉普等[22]發(fā)現(xiàn)幾種天然抗氧化劑提高牡丹籽油氧化穩(wěn)定性結果單獨使用天然抗氧化劑效果弱于TBHQ研究，實驗結果與此一致。

綜上所述，在相同儲藏時間、相同添加量時，5種抗氧化劑延緩核桃油氧化穩(wěn)定性的順序為:TBHQ>BHA>甾醇>維生素E、檸檬酸，與文獻報道數(shù)據(jù)一致[23]。

2.2.2 酸值的分析

酸值是油脂中游離脂肪酸含量的標志，所有核桃油樣品中的游離脂肪酸的含量增加，酸值變大，說明核桃油樣品氧化程度越高。

2.2.2.1 不同添加量甾醇對核桃油酸值結果

由表7可看出，在核桃油中添加100、150、200 mg/kg甾醇，通過恒溫干燥箱溫度為(60±1) ℃加速氧化12 d后，未添加甾醇的空白核桃油酸值增長最高為(1.157±0.042) mg/g。

表7 不同添加量的甾醇對核桃油酸值結果/mg/g

添加量100～150 mg/kg甾醇與空白核桃油酸值分析：第0～4天，差異不顯著(P>0.05)；第6天，差異顯著(P<0.05)；第6～8天，差異不顯著；第10～12天，差異顯著；說明添加量100～200 mg/kg甾醇延緩核桃油氧化，但甾醇添加量較低，抗氧化效果未能12 d內(nèi)均差異顯著。添加量200 mg/kg甾醇與空白核桃油酸值分析：第0～4天，酸值差異不顯著；第6～12天，酸值差異顯著；與過氧化值分析結果一致。

添加甾醇為100～200 mg/kg的核桃油樣酸值均低于空白核桃油，說明甾醇能夠抑制游離脂肪酸的增長，對核桃油均有較強的抗氧化作用；不同添加量甾醇其抗氧化作用隨著甾醇添加量的增大而增強；與過氧化值分析結果一致。

2.2.2.2 甾醇與不同抗氧化劑對核桃油酸值結果

由表8可看出，通過溫度為(60±1) ℃加速氧化12 d后，空白核桃油樣的酸值最高；添加量200 mg/kg的條件下，5種抗氧化劑添加核桃油樣酸值高低依次為: 空白>檸檬酸、維生素E>甾醇>BHA>TBHQ。

表8 甾醇與不同抗氧化劑對核桃油酸值結果/mg/g

添加甾醇和檸檬酸核桃油樣酸值分析：第0天，差異不顯著，第2～12天，差異顯著(P<0.05)，說明甾醇具有抗氧化性，且明顯優(yōu)于天然抗氧化劑檸檬酸，與過氧化值分析結果一致。

添加甾醇和維生素E核桃油樣酸值分析：第0天，差異不顯著，第2～12天，差異顯著，說明甾醇抗氧化優(yōu)于天然抗氧化劑維生素E，與過氧化值分析結果一致。

添加甾醇和TBHQ、BHA核桃油樣，第0～12天，差異顯著，說明添加甾醇抗氧化能力不如TBHQ、BHA，與過氧化值分析結果一致。

在相同儲藏時間、相同添加量時，5種抗氧化劑延緩核桃油氧化穩(wěn)定性的順序為:TBHQ>BHA>甾醇>維生素E、檸檬酸。

2.2.3 甾醇與檸檬酸、維生素E復配研究結果

2.2.3.1 響應面回歸模型方差分析

表9 響應面實驗設計及結果

表10 回歸模型方差分析結果

因此可用此回歸模型分析和預測甾醇、檸檬酸和維生素E對核桃油過氧化值影響。結果顯示，甾醇添加量的一次項A對過氧化值影響顯著(P<0.05)，檸檬酸和維生素E添加量一次項B和C對過氧化值影響不顯著(P>0.05)，此結果與過氧化值和酸值的研究結果一致。由圖4可知，當維生素E添加量一定時，檸檬酸添加量在100～200 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油過氧化值隨著添加量的增大而平緩減小；甾醇添加量為100～200 mg/kg，核桃油過氧化值隨添加量的增大而減小，說明甾醇對核桃油具有抗氧化作用，且隨甾醇添加量的增加抗氧化能力增大；等高線結果說明甾醇與檸檬酸交互作用對核桃油過氧化值影響不顯著。

圖4 甾醇與檸檬酸交互作用對過氧化值影響的響應面圖

由圖5可知，當檸檬酸添加量一定時，維生素E添加量在100～200 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油過氧化值隨添加量的增大而平緩減?。荤薮继砑恿吭?00～200 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油過氧化值隨添加量的增大而減小。等高線結果說明甾醇與維生素E交互作用對核桃油過氧化值影響不顯著。

圖5 甾醇與維生素E交互作用對過氧化值影響的響應面圖

由圖6可知，當甾醇添加量一定時，檸檬酸添加量在100～200 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油過氧化值也隨添加量的增大而先平緩減小后平緩增大；維生素E添加量在100～200 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油過氧化值隨添加量的增大而先平緩減小后平緩增大。等高線結果說明檸檬酸與維生素E交互作用對核桃油過氧化值影響不顯著。

圖6 檸檬酸與維生素E交互作用對過氧化值影響的響應面圖

2.2.3.2 驗證試驗

用模型分析可知，最佳復配組合是200 mg/kg甾醇、163.63 mg/kg檸檬酸、174.66 mg/kg維生素E，過氧化值預測值為14.36 mmol/kg。按最佳復配組合參數(shù)驗證，過氧化值實驗值為14.44 mmol/kg，實驗值與預測值基本一致。通過表10和表6可知，復配組合過氧化值比美藤果油甾醇(29.87±1.98) mmol/kg過氧化值小，接近BHA的過氧化值(8.80±0.70)mmol/kg，說明復配組合對核桃油的抗氧化效果比添加單一甾醇好，和BHA抗氧化效果接近。研究表明，復配抗氧化劑可提高油脂氧化穩(wěn)定性和品質(zhì)，如茶多酚和維生素E等復配，提高棉籽油氧化穩(wěn)定性[24]。

3 結論

將美藤果仁物理壓榨得到美藤果油毛油，美藤果油中甾醇物質(zhì)主要是β-谷甾醇和豆甾醇，豆甾醇含量為(68.74±0.46) mg/100 g，β-谷甾醇含量為(156.47±0.46) mg/100 g；美藤果油豆甾醇平均回收率為102.1%，RSD為0.71%；β-谷甾醇平均回收率為103.9%，RSD為0.56%。

當甾醇的添加量為200 mg/kg 對核桃油抗氧化效果最佳，與空白組差異顯著(P<0.05)；與添加檸檬酸、維生素E核桃油樣差異顯著(P<0.05)；與添加TBHQ、 BHA核桃油樣差異顯著(P<0.05)；5種抗氧化劑對核桃油抗氧化作用效果依次為: TBHQ>BHA>甾醇>維生素E、檸檬酸。甾醇與檸檬酸、維生素E復配，最佳添加量配方為200 mg/kg甾醇、163.63 mg/kg檸檬酸、174.66 mg/kg維生素E，過氧化值為14.44 mmol/kg，復配組合過氧化值接近添加BHA(8.80±0.70)mmol/kg的過氧化值，說明甾醇及復配天然抗氧化劑對核桃油的氧化穩(wěn)定性有一定抗氧化作用。

不同油脂的氧化穩(wěn)定性不同可能與油脂中甾醇的種類及含量不同有關，甾醇對核桃油能在一定程度上抑制油脂氧化酸敗，究其原因，甾醇是油脂中脂溶性天然抗氧化物質(zhì)，加入核桃油中，補充核桃油甾醇內(nèi)源性抗氧化成分，發(fā)揮抗氧化效果；因此甾醇是一種具有開發(fā)潛力的天然脂溶性抗氧化劑，但甾醇對油脂抗氧化機理有待進一步的研究。