汪 雷 胡火軍 馬金陽 黃 松 董元訓(xùn) 王旭光 周有東
缺血性腦卒中是常見的腦血管疾病,約占腦卒 中的80%[1,2]。當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生后,在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血液供應(yīng),反而造成更嚴(yán)重的腦功能障礙,這種現(xiàn)象稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemiareperfusion injury,CIRI)。研究表明,抑制缺血性腦卒中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,可有效改善CIRI[3]。七葉皂苷鈉具有抗炎、消除腫脹、改善微循環(huán)、清除自由基等作用。研究表明,七葉皂苷鈉可以抑制炎癥介質(zhì)的釋放,減輕高原腦損傷及腦水腫[4]。本文探討七葉皂苷鈉大鼠CIRI的作用。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組60 只成年雄性SD 大鼠,8 周齡,體重220~250 g,購自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司。按隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和七葉皂苷鈉組,每組20只。
1.2 建立CIRI 大鼠模型 按參考文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法建立CIRI。腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉后,在頸部正中切開皮膚并鈍性分離各層組織,暴露頸總動(dòng)脈及分支,尼龍線結(jié)扎右頸外動(dòng)脈,動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。右頸外動(dòng)脈、右頸內(nèi)動(dòng)脈以及大腦左前動(dòng)脈殘端處插入拴線并固定,松開動(dòng)脈夾。缺血2 h后,取出拴線結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行上述手術(shù),但不插入拴線。CIRI 大鼠造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠不能直線行走,向右轉(zhuǎn)圈或向右傾倒,提尾時(shí)右前肢彎曲。
1.3 給藥方法 按參考文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法,七葉皂苷鈉組建模1 h后一次性腹腔注射七葉皂苷鈉(2.8 mg/kg;武漢愛民制藥股份有限公司),假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。
1.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 造模后24 h,采用Longa 評(píng)分評(píng)估大鼠神經(jīng)功能[7]:0 分,大鼠行為完全正常;1分,大鼠右前肢不能完全伸直;2分,大鼠爬行時(shí)有向右盤旋的行為;3 分,大鼠爬行時(shí)向右傾倒;4 分,大鼠喪失行走能力,意識(shí)喪失。
1.5 大鼠腦含水量的測(cè)定 造模后24 h,每組取5 只大鼠,脫椎處死取出腦組織,用濾紙吸干表面水分后稱其濕重,然后放置在恒溫干燥箱烘干,稱其干重。腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。
1.6 ELISA 檢測(cè)損傷腦組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)指標(biāo) 造模后24 h,每組取5只大鼠分離損傷腦組織,加入RIPA裂解液均漿,4 ℃離心25 min(2 500轉(zhuǎn)/min),取上清液。按ELISA 試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司)說明書操作,檢測(cè)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6及IL-1β的含量。
1.7 TUNEL 染色檢測(cè)損傷腦組織神經(jīng)元凋亡率 造模后24 h,每組取5 只大鼠,灌注固定后分離損傷腦組織,石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水,加入胰蛋白酶K 工作液,37 ℃處理25 min,洗滌3 次,酒精脫水,按照TUNEL 試劑盒(美國Invitrogen 公司)說明書進(jìn)行操作,用抗熒光淬滅封片后,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目。隨機(jī)選取5個(gè)視野,觀察并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。
1.8 免疫印跡法檢測(cè)損傷腦組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 造模后24 h,每組取5只大鼠分離損傷腦組織,加入RIPA裂解液提取蛋白,使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳,并轉(zhuǎn)至PDVF 膜。5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h,PBS洗滌3次,加入一抗NFκB p65 抗體(1:1 000;美國Invitrogen 公司)、雙特異性 磷 酸 酶1 抗 體(dual- specific phosphatase 1,DUSP1;1:1 000;美國GeneTex公司)、Bcl-2抗體(1:1 000;美國Invitrogen 公司)和Bax 抗體(1:1 000;美國Invitrogen 公司),4 ℃下孵育過夜。TBST 洗膜3 次,加入二抗(1:5 000;美國Invitrogen 公司),37 ℃下孵育1 h,TBST洗膜3次。用ECL試劑盒進(jìn)行顯影。采用圖像分析軟件ImageJ 進(jìn)行灰度值分析,以β-actin作為內(nèi)參。
1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件分析;計(jì)量資料以±s表示,使用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 七葉皂苷鈉對(duì)CIRI 大鼠神經(jīng)功能的影響 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠Longa 評(píng)分顯著增加(P<0.01);與模型組相比,七葉皂苷鈉組大鼠Longa評(píng)分顯著降低(P<0.01)。見圖1。
圖1 七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI后神經(jīng)功能的影響
2.2 七葉皂苷鈉對(duì)CIRI 大鼠腦含水量的影響 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦含水量顯著增加(P<0.01);與模型組相比,七葉皂苷鈉組大鼠腦含水量顯著降低(P<0.01)。見圖2。
圖2 七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI后腦含水量的影響
2.3 七葉皂苷鈉對(duì)CIRI大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠損傷腦組織MDA、TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平顯著增高(P<0.001),SOD 和CAT 水平顯著降低(P<0.001)。與模型組相比,七葉皂苷鈉組大鼠損傷腦組織MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低(P<0.001),SOD和CAT水平顯著增高(P<0.001)。見圖3。
圖3 七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI后損傷腦組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響
2.4 七葉皂苷鈉對(duì)CIRI大鼠損傷腦組織神經(jīng)元凋亡的影響 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠損傷腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.01);與模型組相比,七葉皂苷鈉組大鼠損傷腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著下降(P<0.01)。見圖4。
圖4 七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI后損傷腦組織神經(jīng)元凋亡的影響
2.5 七葉皂苷鈉對(duì)CIRI 大鼠損傷腦組織DUSP1、NF-kB p65、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠損傷腦組織DUSP1 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),NF-kB p65和Bax蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。與模型組相比,七葉皂苷鈉組大鼠損傷腦組織DUSP1和Bcl-2蛋白表達(dá)表達(dá)顯著增高(P<0.05),NF-kB p65和Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖5。
圖5 七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI后損傷腦組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
缺血性腦卒中是一種具有高發(fā)病率、高致殘率和高病死率特點(diǎn)的急性腦血管疾病,是血管性疾病導(dǎo)致病人殘疾和死亡的主要原因之一[8,9]。目前,治療缺血性腦卒中最有效的方法就是及時(shí)進(jìn)行溶栓治療,然而藥物溶栓受到嚴(yán)格的時(shí)間限制(4.5 h 內(nèi)),且容易誘發(fā)CIRI[10,11]。CIRI是大腦短暫供血不足后又快速恢復(fù)供血,從而使氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)加重,導(dǎo)致細(xì)胞自噬、凋亡增加等一系列的病理過程[12,13]。CIRI 后小膠質(zhì)細(xì)胞激活釋放炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等引發(fā)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致繼發(fā)性損傷[14]。此外,在CIRI 過程中,會(huì)產(chǎn)生MDA,下調(diào)包括SOD、CAT 在內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化酶的活性,干擾細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)并誘發(fā)炎癥反應(yīng),從而引起缺血組織的進(jìn)一步損傷[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn),大鼠CIRI后,損傷腦組織MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6 水平顯著增高,SOD和CAT 水平顯著降低,同時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著增加,神經(jīng)功能損傷和腦水腫顯著加重。
七葉皂苷鈉是一種七葉樹科植物中提取的含酯鍵的三萜皂苷,臨床上用于腦水腫、創(chuàng)傷及手術(shù)所致的腫脹,同時(shí)也用于靜脈回流障礙性疾病[17]。研究表明,七葉皂苷鈉通過上調(diào)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子1的表達(dá),發(fā)揮抗炎作用,減輕大鼠腦出血損傷[18]。另外,七葉皂苷鈉可通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1信號(hào)通路,降低炎癥因子水平,減輕氧化應(yīng)激損傷,改善小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血腦屏障及神經(jīng)功能障礙[6]。本研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉能夠顯著降低CIRI后炎癥因子水平,降低MDA 水平,提高SOD 和CAT 水平,促進(jìn)Bcl-2表達(dá),抑制Bax表達(dá),減少細(xì)胞凋亡。
DUSP1 是MAPK 家族成員,可參與T 細(xì)胞的活化,對(duì)免疫性疾病有保護(hù)作用[19]。研究表明,DUSP可使MAPK失活,對(duì)心肌損傷起到保護(hù)作用[20,21]。此外,DUSP1在在心臟缺血再灌注損傷后顯著下調(diào),上調(diào)DUSP1可減輕Mff/Binp3活化,并使JNK信號(hào)通路失活,保護(hù)缺血再灌注應(yīng)激后的心肌組織[22]。還有研究表明DUSP1能夠抑制NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,從而抑制NF-κB的活性[23,24]。NF-κB是一種能激活多種基因表達(dá)的二聚體轉(zhuǎn)錄因子,參與炎癥過程。本研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉能夠顯著促進(jìn)DUSP1 的表達(dá),抑制NF-kB p65的表達(dá)。
總之,七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI 具有神經(jīng)保護(hù)作用,機(jī)制可能是通過促進(jìn)DUSP1 的表達(dá),抑制NFκB活性,發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激,抑制凋亡的作用。