基于細(xì)胞色素B(Cyt b)基因?qū)βN嘴鲌不同群體遺傳多樣性的分析

張桂寧，方弟安,，薛向平，張敏瑩，馮曉婷，楊雪軍

（1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，江蘇無錫 214081）

0 引言

翹嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)隸屬于鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Cultrinae)、鲌屬(Culter)，俗稱白魚、翹嘴白等，是鲌亞科中最大的一種，是太湖“三白”之一，與松江鱸(Trachidermus fasciatus)、黃河鯉(Cyprinus carpio)、松花江鮭(Siniperca chuatsi)被譽(yù)為中國四大名魚[1]。翹嘴鲌?jiān)谥袊植紡V泛，幾乎各個(gè)江流湖泊中都有存在。翹嘴鲌多2～3齡性成熟，生殖季節(jié)在5—7月，5月中旬為盛產(chǎn)期，具有溯河產(chǎn)卵特性，卵黏性，受精卵黏附于水生植物或砂石上發(fā)育[1]。翹嘴鲌生長(zhǎng)迅速，耐低氧，抗病力強(qiáng)，適合高密度養(yǎng)殖，是長(zhǎng)江三角洲地區(qū)的主要名特淡水養(yǎng)殖品種[2]。鑒于翹嘴鲌的重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)地位，受到眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注與研究，目前主要集中在生物學(xué)特征研究[3]、資源現(xiàn)狀[4]、育種[5]胚胎發(fā)育[6]、繁殖[7]、病害[8]和遺傳多樣性[9-11]等方面。

研究遺傳多樣性對(duì)生物多樣性保護(hù)和生物資源可持續(xù)利用有重要意義，由于線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)具有母系遺傳、進(jìn)化速率快等特性，因此，常用作研究親緣物種遺傳多樣性的理想分子標(biāo)記[12]。在mtDNA的13個(gè)蛋白編碼基因中，細(xì)胞色素b基因(Cytochrome b,Cyt b)的結(jié)構(gòu)和功能較為清楚，堿基含量的富集反映出Cyt b基因在密碼子使用上的偏倚性[13-14]。Cyt b基因進(jìn)化速率適中，包含著從種內(nèi)到種間的較強(qiáng)進(jìn)化信號(hào)，故被廣泛地用來進(jìn)行物種多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化等方面的研究[15]。王利華等[16]探討基于CO I和Cyt b DNA條形碼鑒定6種鲌屬魚類（達(dá)氏鲌、海南鲌、尖頭鲌、蒙古鲌、擬尖頭鲌和翹嘴鲌）的可行性，通過計(jì)算其堿基含量、群體間的平均遺傳距離、種內(nèi)遺傳距離和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，研究顯示，線粒體CO I和Cyt b基因可以作為DNA條形碼鑒定鲌屬魚類。王偉[17]應(yīng)用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、內(nèi)部簡(jiǎn)單序列重復(fù)(ISSR)和DNA序列(COII和D-LOOP)分析技術(shù)，對(duì)中國不同地理的7個(gè)群體翹嘴鲌遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了分析，并對(duì)各種標(biāo)記的結(jié)果進(jìn)行了橫向比較，研究顯示AFLP標(biāo)記要略優(yōu)于ISSR標(biāo)記技術(shù)，兩種序列均能提供一定的遺傳信息，但D-LOOP序列進(jìn)化速度更快，另外中國野生翹嘴鲌遺傳多樣性比養(yǎng)殖群體豐富，遺傳結(jié)構(gòu)合理。黃小彧[11]針對(duì)長(zhǎng)江水系不同江段的14個(gè)翹嘴鲌群體，應(yīng)用線粒體控制區(qū)研究其遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)不同江段的翹嘴鲌群體遺傳多樣豐富度不同，表現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性共存的現(xiàn)象，遺傳多樣性較低[11]。

長(zhǎng)江是中國第一大河，對(duì)其漁業(yè)資源遺傳多樣性的研究極其重要，太湖、淀山湖和長(zhǎng)蕩湖均是位于長(zhǎng)江下游的湖泊，是翹嘴鲌的良好棲息場(chǎng)所，近幾年，這些湖泊都有不同程度的富營養(yǎng)化，翹嘴鲌資源有所衰退[18]。翹嘴鲌是“太湖三白”之一，在淀山湖和長(zhǎng)蕩湖中亦為漁業(yè)資源的優(yōu)勢(shì)物種。近年來，基于線粒體DNA對(duì)長(zhǎng)江下游水域翹嘴鲌遺傳多樣性的研究較少。因此，本研究以長(zhǎng)江、長(zhǎng)蕩湖、太湖和淀山湖4個(gè)水域的翹嘴鲌為研究對(duì)象，通過mtDNA Cyt b基因核苷酸序列的比較分析，探討長(zhǎng)江下游4個(gè)水域翹嘴鲌群體的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和群體間的進(jìn)化關(guān)系，以深入了解其遺傳背景和種質(zhì)資源現(xiàn)狀，為翹嘴鲌的野生資源保護(hù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2019年5—8月，使用定制絲網(wǎng)和流刺網(wǎng)分別于淀山湖(DSH)、太湖(TH)、長(zhǎng)蕩湖(CD)和長(zhǎng)江(CJ)水域的固定采樣位點(diǎn)隨機(jī)捕獲收集翹嘴鲌尾鰭樣本，浸泡于無水乙醇中保存，其中淀山湖47尾，太湖40尾，長(zhǎng)蕩湖40尾，長(zhǎng)江84尾，共計(jì)211尾。

1.2 DNA提取

將鰭條樣品剪取約30 mg的組織樣品于離心管中，使用試劑盒法提取DNA（海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化有限公司），并用濃度1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和純度，符合后續(xù)擴(kuò)增要求的DNA樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR和DNA測(cè)序

PCR擴(kuò)增Cyt b基因所需引物序列為Cytb-F:5-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3 Cytb-R:5-CTCCG ATCTCCGGATTACAAGA-3。

PCR反應(yīng)體系：總體積25 μL，包括dNTP Mixture 12 μL，上、下游引物各1.25 μL(50 μmol/L)，DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變形5 min；94℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃結(jié)束。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后，將條帶清晰擴(kuò)增有效的PCR產(chǎn)物送亦欣生物科技（上海）有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物一致。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用MEGA 7.0.26軟件中的Align by clustalW軟件進(jìn)行Cyt b基因原始序列的比對(duì)、剪切。用DNASP v5[19]軟件計(jì)算群體單倍型，DNASP v5軟件進(jìn)行Tajima's D和Fu’s Fs的中性測(cè)試，以衡量群體是否發(fā)生了擴(kuò)張。采用Arlequin 3.5軟件[20]進(jìn)行遺傳多樣性、群體的分子方差分析(Analysis of molecular variance，AMOVA)、遺傳距離和基因流(Nm)值的計(jì)算。在MEGA 7.0.26軟件中以Kimura雙參數(shù)法(Kimura-2-parameter)為替代模型，采用NJ法(Neighbour-joining，NJ)構(gòu)建翹嘴鲌不同群體單倍型的分子聚類樹，從分支關(guān)系分析各群體之間的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

PCR產(chǎn)物基因測(cè)序之后經(jīng)MEGA7.0.26軟件中的Align by Clustal W進(jìn)行原始序列的比對(duì)剪切，得到1088 bp的序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫的翹嘴鲌Cyt b序列比對(duì)，數(shù)據(jù)同源性達(dá)到99%以上。MEGA7.0.26軟件分析211個(gè)個(gè)體序列的堿基組成平均含量為T(27.1%)，C(23.1%)，A(27.9%)，G(21.9%)，A+T含量為55%，G+C為45%。表1中211個(gè)個(gè)體共有46個(gè)單倍型，單倍型多樣性在(0.849±0.004)～(0.946±0.015)，4個(gè)群體中太湖群體的最高，其次是長(zhǎng)蕩湖群體，再次是長(zhǎng)江群體，淀山湖水域的翹嘴鲌單倍型最低。核苷酸多樣性在0.0083～0.174，整體而言核苷酸多樣性較高，其中淀山湖群體＞長(zhǎng)蕩湖群體＞長(zhǎng)江群體＞太湖群體。MEGA7.0.26軟件中分析得到單態(tài)突變位點(diǎn)46個(gè)，簡(jiǎn)約信息點(diǎn)1011個(gè)，變異位點(diǎn)1057，變異率為97.15%，保守位點(diǎn)31個(gè)。DNASP軟件分析得到258個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，約占核苷酸總數(shù)的23.71%。轉(zhuǎn)換與顛換比值(si/sv)為0.7。

表1 不同群體的單倍型及遺傳多樣性參數(shù)

2.2 單倍型分布

在211個(gè)翹嘴鲌個(gè)體共有46個(gè)單倍型，其中Hap1、Hap2、Hap3、Hap4和Hap8在長(zhǎng)江和長(zhǎng)蕩湖群體中共享，其余41個(gè)單倍型分別在4個(gè)地理群體中獨(dú)有，占單倍型的89.13%，其中Hap5、Hap6和Hap10-Hap19在長(zhǎng)江群體中特有，Hap20-Hap34、Hap45及Hap46在淀山湖群體中獨(dú)有，Hap7、Hap9和Hap40在長(zhǎng)蕩湖中特有，Hap35-Hap39和Hap41-Hap44在太湖群體中獨(dú)有。

通過Network軟件繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示，每個(gè)圓代表一個(gè)單倍型，其大小與總頻率成正比，圓圈大小表示該單倍型出現(xiàn)的次數(shù)。每個(gè)單倍型按地理分布用不同的顏色表示，4個(gè)地理群體的單倍型構(gòu)成一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖，只有長(zhǎng)江群體的長(zhǎng)蕩湖群體有共享單倍型，長(zhǎng)江群體和淀山湖群體的單倍型散布在各個(gè)位置，其余群體的單倍型分布較均勻。圖中圓的面積代表出現(xiàn)次數(shù)，由圖可知，Hap2出現(xiàn)次數(shù)最多為54次，包含長(zhǎng)江群體和長(zhǎng)蕩湖群體，其次是Hap41，出現(xiàn)23次，屬于太湖群體。Hap14出現(xiàn)22次，屬于長(zhǎng)江群體。

圖1 4個(gè)地理群體翹嘴鲌的單倍型分布網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 遺傳分化分析

由MEGA7.0.26軟件中的Data-distance計(jì)算出的4個(gè)地理群體的遺傳距離如表2所示，在表中可看出種內(nèi)遺傳距離的范圍是0.01～0.04，其中太湖群體的種內(nèi)遺傳距離是0.01，長(zhǎng)蕩湖群體的種內(nèi)遺傳距離最大，達(dá)到0.04。4個(gè)群體的種間遺傳距離0.052～0.152，太湖群體和淀山湖群體的種間遺傳距離最遠(yuǎn)是0.152。

表2 不同翹嘴鲌群體遺傳距離

4個(gè)地理的翹嘴鲌群體基因流和遺傳分化指數(shù)如表3和4所示，從表中顯示出兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)范圍在0.197～0.646?；蛄髦档姆秶鸀?.152～1.010，其中長(zhǎng)江和淀山湖群體的基因流值最小為0.152，長(zhǎng)江與長(zhǎng)蕩湖群體的基因流值最大為1.019。

表3 不同翹嘴鲌群體基因流(Nm)及遺傳分化指數(shù)(Fst)

表4 4個(gè)翹嘴鲌地理群體間遺傳分化參數(shù)

2.4 聚類分析

應(yīng)用MEGA7.0.26軟件對(duì)211個(gè)翹嘴鲌個(gè)體的Cyt b的序列進(jìn)行聚類分析，得出4個(gè)翹嘴鲌群體46個(gè)單倍型的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2所示。不同地理來源的單倍型總共分成7個(gè)大分支，Hap25、Hap28、Hap31和Hap33獨(dú)自各成一支，屬于太湖群體。Hap30和Hap34組成一支，亦屬于太湖群體，Hap45獨(dú)自為一支，屬于淀山湖群體，剩余一支包含很多單倍型，其中不同地理群體的單倍型散亂分布。

圖2 4個(gè)地理群體翹嘴鲌的單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 4個(gè)翹嘴鲌群體錯(cuò)配分布圖

用DNASPv5軟件分析得到如圖3所示的錯(cuò)配分布圖，由圖3可知，當(dāng)把4個(gè)水域的翹嘴鲌群體作為一個(gè)整體分析時(shí)，其歧點(diǎn)分布圖大體呈現(xiàn)為單峰。

圖3 錯(cuò)配分布曲線

3 討論

3.1 序列組成特點(diǎn)

本研究中211個(gè)個(gè)體序列的堿基組成平均含量為T(27.1%)，C(23.1%)，A(27.9%)和 G(21.9%)，A+T 的含量占55%，G+C占45%，表現(xiàn)出A+T的含量高于G+C的含量。與張久盤[21]文中A+T含量為56.8%，G+C含量為43.2%；馮曉宇[22]文中的A+T含量為56.6%，G+C含量為43.4%，研究結(jié)果相一致，均表現(xiàn)出堿基偏倚性，符合大多數(shù)硬骨魚的特征[22]。

3.2 翹嘴鲌地理群體遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)，黃小彧[11]等對(duì)線粒體DNA序列遺傳變異的研究表明，若單倍型多樣度(Hd)高于0.5且核苷酸多樣度(Pi)低于0.005，是受瓶頸效應(yīng)后群體快速擴(kuò)張導(dǎo)致，表明該群體的遺傳多樣性水平低；如果單倍型多樣度(Hd)高于0.5且核苷酸多樣度(Pi)高于0.005，則該群體遺傳多樣性水平較高[23]。本研究中整個(gè)翹嘴鲌群體的遺傳多樣性水平較高，遺傳多樣性豐富，與徐丹丹[24](Hd:0.948，Pi:0.017)，徐宇[25](Hd:0.969，Pi:0.2008)和張久盤[21](Hd:0.998，Pi:0.039)的研究結(jié)果一致。本研究中長(zhǎng)江群體表現(xiàn)出高的單倍型多樣性和高的核苷酸多樣性，與黃小彧等[11]的結(jié)果(Hd:0.866，Pi:0.00330)存在差異，可能是黃小彧等研究中使用的是線粒體控制區(qū)，控制區(qū)是線粒體DNA的高突變區(qū)；還可能是近幾年長(zhǎng)江的水域魚類生境優(yōu)化和資源恢復(fù)措施導(dǎo)致長(zhǎng)江翹嘴鲌的遺傳多樣性較高。

遺傳多樣性的高低通常由遺傳距離的大小來反映，種內(nèi)個(gè)體間遺傳距離小，彼此間親緣關(guān)系近，說明遺傳多樣性低，反之，遺傳距離大則遺傳多樣性高[17]。本研究中4個(gè)地理群體的種內(nèi)遺傳距離的范圍是0.01～0.04，其中長(zhǎng)江群體和長(zhǎng)蕩湖群體的種內(nèi)遺傳距離相同且最大，遺傳多樣性較高，太湖群體的種內(nèi)遺傳距離最小，遺傳多樣性也較低，與王偉等[17]的研究結(jié)果一致。通常情況下，地理距離越遠(yuǎn)，群體間遺傳距離也就越大，而徐丹丹等[24]在基于微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體Cyt b基因序列針對(duì)鲇(Silurus asotus)遺傳多樣性的研究一文中，發(fā)現(xiàn)不同鲇群體遺傳距離與其地理距離之間沒有相關(guān)性；沙航等[26]基于COI序列分析長(zhǎng)江中上游6個(gè)鰱(Hypophthalmichthys molitrix)地理群體遺傳多樣性也斧正了遺傳距離的大小與群體地理距離沒有明顯相關(guān)性。本研究中淀山湖距離長(zhǎng)蕩湖比距離太湖遠(yuǎn)，但淀山湖群體與長(zhǎng)蕩湖群體的遺傳距離小于淀山湖群體與太湖群體的遺傳距離，這3個(gè)湖泊的翹嘴鲌群體之間遺傳距離與其分布的地理距離亦沒有相關(guān)性，這一結(jié)果與上述研究結(jié)果類似。

群體遺傳學(xué)中通常以Fst值的大小作為衡量群體間遺傳分化程度的常見指標(biāo)，F(xiàn)st＜0.05表示群體間是低度分化；0.05＜Fst＜0.15 表示群體間是中度分化；0.15＜Fst＜0.25表示群體間是高度分化；0.25＜Fst＜1表示群體間有極大的遺傳分化[27]。本研究中長(zhǎng)江翹嘴鲌群體和長(zhǎng)蕩湖群體的Fst相對(duì)較小，為0.197，屬于高度分化，長(zhǎng)江群體、淀山湖群體和太湖群體間的Fst值較大，屬于極大分化，這有可能是研究水域存在地理隔離，翹嘴鲌群體間不存在基因交流。群體間平均凈遺傳距離(Da)是衡量群體間分化程度的重要指標(biāo)，值越大，群體間的遺傳分化程度越大[24,28]。長(zhǎng)蕩湖和太湖群體的平均凈遺傳距離相對(duì)其它群體之間較大(0.48)，遺傳分化程度高，與其遺傳分化指數(shù)較高的研究結(jié)果相一致。本研究中4個(gè)群體之間的基因流值都小于4，研究結(jié)果進(jìn)一步說明了4個(gè)翹嘴鲌群體之間基因交流較少，存在一定程度的遺傳分化現(xiàn)象，這與陳會(huì)娟等[29]的結(jié)果一致。

3.3 翹嘴鲌群體歷史動(dòng)態(tài)

一般要判斷某一群體有沒有發(fā)生過群體擴(kuò)張，有兩種方法：中性檢測(cè)和歧點(diǎn)分布分析[11,30-31]。本研究用這兩種方法來分析了翹嘴鲌群體的種群歷史動(dòng)態(tài)情況。當(dāng)檢測(cè)數(shù)值為負(fù)值，且具有顯著意義時(shí)，則認(rèn)為該群體曾發(fā)生過群體擴(kuò)張現(xiàn)象，如果群體發(fā)生過擴(kuò)張，則歧點(diǎn)分布圖呈現(xiàn)出單峰；如果群體未經(jīng)歷過擴(kuò)張，呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，則其歧點(diǎn)分布圖呈現(xiàn)為多峰[11]。對(duì)211個(gè)翹嘴鲌個(gè)體的Cyt b中性檢驗(yàn)得出Tajima's D值，除了長(zhǎng)蕩湖群體，其余群體都為負(fù)值，且長(zhǎng)江和太湖群體的Tajima's D表現(xiàn)出極顯著性差異P＜0.01，表明群體在歷史上曾發(fā)生過群體擴(kuò)張。淀山湖群體的Tajima's D為負(fù)值，但不具有顯著性差異。除此之外，歧點(diǎn)分布圖顯示，4個(gè)翹嘴鲌地理群體的錯(cuò)配分布曲線中，將所有翹嘴鲌群體作為一個(gè)整體分析，錯(cuò)配曲線呈現(xiàn)單峰，說明該翹嘴鲌群體發(fā)生過群體擴(kuò)張，這與張力文等[23]的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

本研究對(duì)4個(gè)水域的翹嘴鲌進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析，采樣點(diǎn)覆蓋長(zhǎng)江下游典型水域，樣本較多。結(jié)果顯示4個(gè)地理水域的翹嘴鲌群體，表現(xiàn)出高的單倍型和高的核苷酸多樣性，遺傳多樣性較為豐富，群體間都存在遺傳分化，分化程度不同。研究表明，線粒體DNA Cyt b可以作為評(píng)估翹嘴鲌的遺傳多樣性和種質(zhì)資源現(xiàn)狀的有效分子標(biāo)記，研究結(jié)果為翹嘴鲌種質(zhì)資源評(píng)估和保護(hù)提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。后續(xù)研究將繼續(xù)增加野生翹嘴鲌群體的樣品數(shù)量和研究水域，采用多種分子標(biāo)記方法，全面而系統(tǒng)的評(píng)估長(zhǎng)江下游各個(gè)水域翹嘴鲌的種質(zhì)資源狀況和分析其遺傳結(jié)構(gòu)。