李波卡，馮虎元，潘建斌*

(1 蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730000；2 中國(guó)科學(xué)院 植物研究所，系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093)

藜科(Chenopodiaceae Vent.)植物約有130余屬1 500余種，主要分布于南部非洲、中亞、北美洲、南美洲及大洋洲的干草地、荒漠、鹽堿地，以及地中海、黑海、紅海沿岸。傳統(tǒng)上，莧科(Amaranthaceae Juss.)被認(rèn)為是藜科的近緣類群。而分子證據(jù)顯示，藜科的多節(jié)草亞科(Polycnemoideae Ulbr.)與莧科成姊妹群關(guān)系[1]，表明藜科是并系群。因此自APGⅡ系統(tǒng)開始[2]，狹義藜科和莧科合并成廣義莧科。為避免混亂，以下采用多識(shí)植物分類系統(tǒng)[3]中的廣義莧科分類框架進(jìn)行闡述。

苞藜屬(BaoliaKung et G. L. Chu)是根據(jù)1978年孔憲武等在甘肅省迭部縣發(fā)現(xiàn)的苞藜(BaoliabracteataKung et G. L. Chu)新種建立的單型屬[4]，由于采樣困難等諸多因素，尚無(wú)分子水平的研究。形態(tài)學(xué)上苞藜屬通過(guò)不同的特點(diǎn)被認(rèn)為與不同的類群具有較近的親緣關(guān)系：苞藜具有平坦的葉、兩性花、5枚雄蕊、環(huán)形胚，這些特征與藜族(Chenopodieae Dumort.)一致；但其每朵花均具2枚膜質(zhì)小苞片及1枚苞片，顯示其具有堿蓬亞族(Suaedinae Dumort.)的特征。此外，苞藜屬種皮木質(zhì)且增厚，表面有獨(dú)特的小凹陷，表明其可能與環(huán)翅蓬屬(BienertiaBunge ex Boiss.)有較近的關(guān)系?！吨袊?guó)植物志》[5]將苞藜屬放在環(huán)胚亞科(Cyclolobeae C. A. Mey.)藜族。之后，朱格麟[6]對(duì)苞藜屬的系統(tǒng)位置進(jìn)行修訂，將其放在了環(huán)胚亞科多節(jié)草族(Polycnemeae Dum.)。Kühn的系統(tǒng)中苞藜屬位于藜亞科(Chenopodioideae Burnett)[7]，而Zhu等[8]認(rèn)為，苞藜屬應(yīng)被放在堿蓬亞科(Suaedioideae Ulbr.)苞藜族(Baolieae Kung)。多識(shí)植物分類系統(tǒng)則將苞藜屬置于藜亞科藜族[3](表1)。上述所有觀點(diǎn)均缺少分子系統(tǒng)學(xué)證據(jù)，因此，通過(guò)分子手段確定苞藜屬的系統(tǒng)位置非常有必要。

表1 苞藜屬的分類歷史

分子鐘定年方法現(xiàn)已廣泛用于生物類群分化年代的推斷，該方法可通過(guò)整合化石證據(jù)從而得到各節(jié)點(diǎn)的絕對(duì)分化時(shí)間與置信區(qū)間[9]。藜粉(ChenopodipollismultiplexKrutzsch)[10]和擬鹽角(SalicornitesmassalongoiPrincipi)[11]是2個(gè)年代分別為65～56 Ma和35～23 Ma的藜亞科植物化石記錄，在過(guò)去的研究中已被用于推測(cè)系統(tǒng)發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)分化年代[1, 12]。傳統(tǒng)上，苞藜屬因其較原始的形態(tài)學(xué)特征而被認(rèn)為是一個(gè)原始屬[13]。本研究基于核基因片段(ITS)和葉綠體基因片段(atpB-rbcL，rbcL)等序列構(gòu)建莧科物種系統(tǒng)發(fā)育樹，同時(shí)采用上述化石記錄對(duì)分子鐘進(jìn)行校正，探討苞藜屬的系統(tǒng)位置與分化時(shí)間。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

莧科植物材料取自野外(表2)，使用硅膠對(duì)采集的新鮮葉片進(jìn)行快速干燥，之后在實(shí)驗(yàn)室完成DNA的提取。

1.2 DNA提取和樣品測(cè)序

選取核糖體RNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS、葉綠體rbcL和葉綠體非編碼區(qū)atpB-rbcL片段，進(jìn)行序列擴(kuò)增、測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析。除對(duì)所采集物種進(jìn)行測(cè)序外，其他物種的基因序列下載自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源與GenBank序列號(hào)

1)總DNA提取。使用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒完成總DNA的提取。

2)目的片段擴(kuò)增。采用文獻(xiàn)[14]中的引物與PCR反應(yīng)條件，完成ITS、rbcL、atpB-rbcL三個(gè)目的片段的擴(kuò)增。PCR過(guò)程使用 2720 熱循環(huán)儀，反應(yīng)體系 40 μL：DNA 2 μL，dNTPs 10 mmol/L，引物 2 μL(每種引物5 μmol/L), DNA聚合酶4 U，緩沖液4 μL，ddH2O 26.4 μL。取200～1 000 μg基因組DNA完成對(duì)ITS、rbcL、atpB-rbcL片段的擴(kuò)增。

3)純化與測(cè)序。使用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的通用型DNA純化回收試劑盒完成PCR產(chǎn)物純化，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

MEGA 7[15]軟件內(nèi)置的Muscle程序被用于多序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果經(jīng)手動(dòng)調(diào)整后保存為fasta格式。rbcL、atpB-rbcL兩個(gè)數(shù)據(jù)集采用多基因聯(lián)合分析，經(jīng)Sequence Matrix V1.7.8[16]完成拼接后組裝為一個(gè)序列矩陣。ITS 序列與rbcL、atpB-rbcL拼接后的序列數(shù)據(jù)使用PGDspider V2.1.1.5[17]轉(zhuǎn)換成nexus格式，分別用于Beast V1.10.4[18]進(jìn)行貝葉斯樹構(gòu)建，用IQ-TREE[19]進(jìn)行最大似然樹的構(gòu)建。

在貝葉斯樹的構(gòu)建中，使用PAUP V4.0[20]對(duì)ITS、atpB-rbcL+rbcL兩個(gè)序列矩陣的nexus文件進(jìn)行打分測(cè)試，將得到的打分(score)文件使用Mrmodeltest V2.3[21]選出最適核酸替代模型(在AIC標(biāo)準(zhǔn)下，ITS數(shù)據(jù)為 GTR+I+G，atpB-rbcL數(shù)據(jù)為GTR+G，rbcL數(shù)據(jù)為GTR+I+G)。Beast V1.10.4[18]用于對(duì)上述核基因ITS數(shù)據(jù)與葉綠體基因atpB-rbcL+rbcL數(shù)據(jù)進(jìn)行貝葉斯分析與分化時(shí)間評(píng)估。運(yùn)行Beast V1.10.4軟件內(nèi)置的 BEAUti V1.10.4程序生成xml文件。具體步驟如下：(1)在替代模型的選擇中，atpB-rbcL設(shè)定為GTR+G模型，ITS、rbcL均設(shè)定為GTR+I+G；(2)所有數(shù)據(jù)集采用對(duì)數(shù)正態(tài)分布的非相關(guān)寬松分子鐘模型(uncorrelated relaxed log normal molecular clock model)[22]；(3)樹先驗(yàn)(tree prior)選擇生滅過(guò)程(Birth-Death Process)[23]，并使用隨機(jī)起始樹(random starting tree)；(4)采用年代(百萬(wàn)年，Ma)分別為 65～56 Ma 和35～23 Ma的藜粉(Chenopodipollismultiplex)和擬鹽角(Salicornitesmassalongoi)2個(gè)化石記錄，分別標(biāo)定系統(tǒng)發(fā)育樹根節(jié)點(diǎn)以及鹽角草亞族(Salicorniinae Ulbr.)冠群分化年代；(5)系統(tǒng)發(fā)育樹根部及鹽角草亞族年代均設(shè)置為正態(tài)分布，均值/標(biāo)準(zhǔn)差分別設(shè)置為：60.5/2和29/2.5，其他先驗(yàn)采用默認(rèn)設(shè)置；(6)執(zhí)行參數(shù)(Operators)采用默認(rèn)設(shè)置；(7)馬爾可夫鏈-蒙特卡洛算法運(yùn)行代數(shù)為8×107，抽樣頻率為每1 000代。生成的xml文件經(jīng)Beast V1.10.4運(yùn)行后，使用Tracer V1.7.1[24]對(duì)各參數(shù)的有效樣本容量(effective sample size，ESS)進(jìn)行收斂性(convergence)評(píng)估，老化樣本(burn-in)設(shè)置為10%，使用TreeAnnotator V1.10.4程序總結(jié)最大分支可信度樹(maximum clade credibility tree)以及各節(jié)點(diǎn)的后驗(yàn)概率(posterior probability,PP)、95%最高后驗(yàn)密度區(qū)間(highest posterior density heights interval, HPD)以及Median heights。

使用IQ-TREE提供的WEB服務(wù)器[25]完成最大似然樹的構(gòu)建。核酸替代模型選擇采用IQ-TREE整合的ModelFinder模塊[26]，在BIC標(biāo)準(zhǔn)下，ITS數(shù)據(jù)的最適模型為SYM+I+G4，atpB-rbcL數(shù)據(jù)的最適模型為 K3Pu+F+G4，rbcL數(shù)據(jù)的最適模型為TPM3u+F+I+G4。使用IQ-TREE支持的超快自展(ultrafast bootstrap)[27]，自展值(bootstrap,BS)設(shè)置為1000。系統(tǒng)發(fā)育樹分支中，貝葉斯樹后驗(yàn)概率≥0.95或最大似然樹自展值≥95視為高支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

ITS序列矩陣包含物種33個(gè)，67條序列。序列長(zhǎng)度為686 bp，其中變異位點(diǎn)390個(gè)(56.9%)，保守位點(diǎn)286個(gè)(41.7%)。通過(guò)Beast分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹見(jiàn)圖1，最大似然樹與貝葉斯樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，不同之處是平臥堿蓬(Suaedaprostrata)以低支持率(BS=76)與豬毛菜族(Salsoleae Dumort.)聚成一支。結(jié)果顯示，千針莧屬(AcroglochinSchrad.)、蟲實(shí)屬(Corispermum)、苞藜屬(Baolia)組成的分支以低支持率(PP=0.88/BS=64)嵌入藜族(Chenopodieae)，且以低支持率(PP=0.58/BS=53)與藜屬(ChenopodiumL.)、單性濱藜屬(ArchiatriplexG. L. Chu)、刺壤藜屬(GrayiaHook. et Arn.)、濱藜屬(AtriplexL.)形成的分支(PP=1/BS=100)互為姊妹群。在鹽角草族(Salicornieae Dumort.)中，平臥堿蓬(Suaedaprostrata)與堿蓬(Suaedaglauca)、鹽角草亞族(Salicorniinae)組成的分支(PP=0.75/BS=88)形成姊妹群關(guān)系。樟味藜族(Camphorosmeae Moq.)、豬毛菜族各屬以高支持率(PP=1/BS=99)形成一單系群。

后驗(yàn)概率展示在分支上，自展值展示在分支下；對(duì)節(jié)點(diǎn)年代的測(cè)定展示在節(jié)點(diǎn)后，同時(shí)展示95%置信區(qū)間；下同圖1 基于ITS序列數(shù)據(jù)集的Beast分析分子鐘系統(tǒng)發(fā)育樹Posterior probabilities are shown above branches, bootstrap values of the maximum likelihood analysis are shown below branches; Estimated ages of nodes are given behind the respective node, and corresponding bars demonstrate 95% confidence intervals; The same as belowFig.1 Molecular phylogenetic tree from the Beast analysis based on the ITS sequence dataset

2.2 基于atpB-rbcL+rbcL聯(lián)合序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

atpB-rbcL+rbcL聯(lián)合序列矩陣包含物種35個(gè)，61條序列。拼接后序列總長(zhǎng)度為1 992 bp，其中變異位點(diǎn)有422個(gè)(21.2%)，保守位點(diǎn)1 570個(gè)(78.8%)。Beast分析得到的系統(tǒng)關(guān)系樹見(jiàn)圖2，最大似然樹與貝葉斯樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大致相同。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，苞藜屬(Baolia)、沙蓬屬(AgriophyllumM. Bieb.)、合被蟲實(shí)屬(AnthochlamysFenzl)與蟲實(shí)屬(Corispermum)共同構(gòu)成一較高支持率的單系群(PP=1/BS=93)，且苞藜屬以高支持率聚為一支(Baolia:PP=1/BS=100)。由上述4屬形成的分支在一般支持率下與藜族(Chenopodieae)形成姊妹群關(guān)系(PP=0.83/BS=100)。由于沒(méi)有得到序列信息，千針莧屬(Acroglochin)并未包括在此次分析中。與ITS分析不同，鹽角草亞族(Salicorniinae)和堿蓬亞族(Suaedinae)形成高支持率(PP=0.99/BS=100)的姊妹群關(guān)系。豬毛菜族(Salsoleae)、樟味藜族(Camphorosmeae)以高支持率聚為一單系群(PP=0.99/BS=98)。

圖2 Beast分析得到的基于atpB-rbcL+rbcL聯(lián)合序列數(shù)據(jù)集的分子鐘系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Molecular phylogenetic tree from the Beast analysis based on the concatenated sequence of atpB-rbcL and rbcL

2.3 分化時(shí)間估計(jì)

表3展示由Beast V1.10.4分子鐘定年得到的結(jié)果，總結(jié)了ITS序列、atpB-rbcL+rbcL聯(lián)合序列中主要節(jié)點(diǎn)的分化年代(均值及95%置信區(qū)間)。苞藜屬的分化時(shí)間在2棵樹上分別為17.0和28.7 Ma前。

3 討 論

3.1 苞藜屬與蟲實(shí)族的單系性

分別基于核ITS序列以及基于葉綠體atpB-rbcL+rbcL聯(lián)合序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，苞藜屬(Baolia)在atpB-rbcL+rbcL系統(tǒng)發(fā)育樹中與藜亞科(Chenopodioideae)蟲實(shí)族(Corispermeae)的沙蓬屬(Agriophyllum)、合被蟲實(shí)屬(Anthoch-lamys)、蟲實(shí)屬(Corispermum)互為姊妹群(PP=1/BS=93)。而在ITS系統(tǒng)發(fā)育樹中苞藜屬與蟲實(shí)屬也以較高的支持率聚成一支(PP=0.92/BS=89)，表明苞藜屬與蟲實(shí)族具有較近的親緣關(guān)系，這與傳統(tǒng)上基于形態(tài)學(xué)對(duì)苞藜屬分類地位的劃分有很大不同[4, 6-8]。從形態(tài)上看，苞藜屬與蟲實(shí)族其他類群均為具有平坦葉的一年生草本，具兩性花且花柱二枚。然而苞藜屬的獨(dú)特之處在于：1)蟲實(shí)族植物常被毛，而苞藜屬無(wú)毛；2)蟲實(shí)族植物花序穗狀，苞藜屬的花則簇生葉腋；3)蟲實(shí)族植物不具小苞片而苞藜屬存在小苞片。從分布來(lái)看，蟲實(shí)族在亞洲、歐洲及北美洲(蟲實(shí)屬)均有分布，在中國(guó)分布于東北、華北、西北和青藏高原，而苞藜屬為中國(guó)特有，僅分布于甘肅西南部的迭部縣。

表3 使用Beast程序得到的分歧時(shí)間(百萬(wàn)年)評(píng)估結(jié)果(括號(hào)內(nèi)為95%置信區(qū)間)

通過(guò)以上分析認(rèn)為,苞藜屬應(yīng)放在藜亞科(Chenopodioideae)，又因其系統(tǒng)地位、形態(tài)學(xué)與地理分布的特殊性，將其單獨(dú)放在苞藜族(Baolieae)。

3.2 蟲實(shí)族的系統(tǒng)位置

ITS和atpB-rbcL+rbcL數(shù)據(jù)集得到的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，蟲實(shí)族與藜族(Chenopodieae)關(guān)系密切。ITS系統(tǒng)樹分析顯示，藜族為一并系群，蟲實(shí)族聚成較高支持率的單系(PP=0.92/BS=89)并嵌入藜族內(nèi)部。而在atpB-rbcL+rbcL系統(tǒng)樹中，蟲實(shí)族與藜族成員互為姊妹群(PP=0.83/BS=100)。在過(guò)去的一些基于葉綠體基因的研究中，也得到了蟲實(shí)族與藜族成姊妹群關(guān)系的證據(jù)[28-30]。Berner 等[31]在一項(xiàng)基于核基因ITS的研究中發(fā)現(xiàn)，太平洋蟲實(shí)(CorispermumpacificumMosyakin)與異被濱藜亞族(Suckleyinae G. L. Chu et Stutz)的土荊芥[ChenopodiumambrosioidesL.=Dysphaniaambrosioides(L.) Mosyakin et Clemants]和 異被濱藜[Suckleyasuckleyana(Torr.) Rydb.]形成的分支互為姊妹群，和藜亞族(Chenopodiinae Scott)、軸藜亞族(Axyridinae Heklau)、甜菜族(Beteae Volkens)形成一多枝結(jié)構(gòu)。而Kadereit 等[1]發(fā)現(xiàn)蟲實(shí)族與豬毛菜族(Salsoleae)、鹽角草族(Salicornieae)、樟味藜族(Camphorosmeae)形成的分枝聚在一起。從形態(tài)上看，蟲實(shí)族的3個(gè)屬：蟲實(shí)屬(Corispermum)、合被蟲實(shí)屬(Anthochlamys)和沙蓬屬(Agriophyllum)，具有平坦的葉、分枝狀毛被和穗狀花序等。因此，相比于豬毛菜族、樟味藜族、甜菜族和鹽角草族，蟲實(shí)族的形態(tài)學(xué)特征也與藜族更為接近。

本研究結(jié)果支持蟲實(shí)族作為一個(gè)穩(wěn)定單系群的地位，并且它與藜族有著更為緊密的關(guān)系。

3.3 苞藜屬的分化時(shí)間

基于狹義藜科(Chenopodiaceae)植物屬種在現(xiàn)代的分布格局及親緣關(guān)系，朱格麟[13]推測(cè)狹義藜科在早白堊紀(jì)起源于中國(guó)西南部，并且苞藜屬(Baolia)是一個(gè)原始屬。與大多數(shù)狹義藜科植物干旱缺水的生境不同，苞藜(Baoliabracteata)的生境相對(duì)濕潤(rùn)。研究表明，苞藜屬與蟲實(shí)屬(Corispermum)在28.7～17.0 Ma間分化，即晚漸新世至中中新世。從地史上看，該時(shí)期喜馬拉雅造山運(yùn)動(dòng)使造山帶東部的夏季降雨量增加，也加重了中國(guó)西北部的干旱程度。因此我們推測(cè)，苞藜屬與蟲實(shí)屬的共同祖先是起源于中國(guó)西南部的狹義藜科原始類群的后代，并在晚漸新世至中中新世之間與蟲實(shí)族其他類群分化，苞藜屬適應(yīng)了濕潤(rùn)的氣候，并在第三紀(jì)末的氣候轉(zhuǎn)冷至第四紀(jì)冰期得以幸存，在約3.1～0.6 Ma出現(xiàn)了種內(nèi)分化，可能是由于冰期時(shí)其分布范圍收縮引起的地理隔離導(dǎo)致。蟲實(shí)屬、合被蟲實(shí)屬(Anthochlamys)和沙蓬屬(Agriophyllum)則適應(yīng)了干旱環(huán)境，在歐亞大陸廣泛擴(kuò)散。其中，蟲實(shí)屬最終可能沿白令陸橋在北美洲登陸[32-33]。由于缺少化石材料，對(duì)苞藜的研究還需進(jìn)一步深入。此外，因苞藜分布域狹小且生境受到人為干擾，故在此呼吁盡快對(duì)其開展(異地)保護(hù)工作，加強(qiáng)物種生物學(xué)研究。

致謝：感謝任廣朋、蘇敏在數(shù)據(jù)分析、實(shí)驗(yàn)操作中提供的幫助。