張雅楠，黃 蕾，張 雷，賈媛媛，李佳彬，黨振華*

(1 內(nèi)蒙古大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院, 蒙古高原生態(tài)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/內(nèi)蒙古草地生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 呼和浩特 010021; 2 內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院, 呼和浩特 010010; 3 內(nèi)蒙古大青山森林生態(tài)系統(tǒng)定位觀測研究站, 呼和浩特 010010)

遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是評價(jià)特定物種及其種群生存現(xiàn)狀的重要指標(biāo)。前者是任何物種或群體應(yīng)對外界環(huán)境壓力并得以延續(xù)的內(nèi)在基礎(chǔ)，而遺傳結(jié)構(gòu)則是生物適應(yīng)、物種形成及進(jìn)化的表現(xiàn)[1]。評價(jià)物種遺傳多樣性，剖析群體遺傳結(jié)構(gòu)，是適應(yīng)進(jìn)化研究的兩個(gè)重要內(nèi)容，對種質(zhì)資源的保護(hù)與開發(fā)具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)價(jià)值[2]。DNA分子標(biāo)記因數(shù)量多、含有的變異信息豐富、受環(huán)境因素影響小，成為群體遺傳學(xué)研究的有效工具[3]。SSR(simple sequence repeat)又稱微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)，通常是由1～6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)成幾十個(gè)核苷酸的DNA序列，具有在真核生物基因組中分布廣泛、多態(tài)性高、共顯性等特點(diǎn)[4-5]，是最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于玉米(Zeamays)[6-7]、煙草(Nicotianatabacum)[8-9]、狗尾草(Setariaviridis)[10]、甜菜(Betavulgaris)[11-12]、丹參(Salviamiltiorrhiza)[13-14]等植物的種群遺傳、起源與進(jìn)化、種質(zhì)資源保護(hù)等研究。EST-SSR(express sequence tag-SSR)是位于基因轉(zhuǎn)錄序列中的微衛(wèi)星DNA，因其具有易開發(fā)、多態(tài)性豐富、種間通用性好、對特定基因的功能有潛在影響等特性，在遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)特性鑒定、目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選、功能基因組等領(lǐng)域中均有應(yīng)用。得益于高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，大量研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在非模式物種中進(jìn)行了EST-SSR的識別、特性分析及標(biāo)記開發(fā)，極大推動了該標(biāo)記自身特性的研究及其在相關(guān)研究中的應(yīng)用。呂冰冰等[15-16]利用EST-SSR標(biāo)記，并結(jié)合SSR標(biāo)記和SRAP標(biāo)記構(gòu)建了小麥(Triticumaestivum)遺傳連鎖圖譜，豐富了小麥功能分子標(biāo)記的數(shù)量；Ranathunge等[17]報(bào)道了向日葵(Helianthusannuus)EST-SSR的變異與不同種群特定基因的差異表達(dá)相關(guān)；在種群遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)記的引物擴(kuò)增成功率、等位基因數(shù)目、多態(tài)性及種間通用性均與基因組SSR相似，并能客觀評價(jià)物種的遺傳多樣性，表現(xiàn)出EST-SSR標(biāo)記在該方面研究中的巨大潛力[18-19]。

檉柳(Tamarix)是起源于第三紀(jì)的古老植物，全球約有90個(gè)種，主要分布于歐洲、亞洲和非洲的干旱、半干旱草原及鹽堿地帶[20]。中國的檉柳資源集中分布在華北、東北和華東等地的沙荒地、干旱鹽堿地及鹽堿濕地，常見于草地、灘涂、河谷及海濱沙地。該屬植物具有抗旱、抗風(fēng)沙、抗病蟲害、抗鹽堿和耐水濕的能力，常形成大面積檉柳純林，具有極強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，在鹽堿地造林綠化方面具有廣泛的應(yīng)用前景，是營造水土保持林、沿海灘涂及河岸防護(hù)林的優(yōu)良樹種[21]。此外，檉柳易于培育薪炭林，可用作園林景觀植物；其細(xì)嫩枝葉可入藥，荒漠區(qū)檉柳根部常有野生管花肉蓯蓉寄生，具有一定的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[22]。目前，國內(nèi)外學(xué)者主要從生物學(xué)特征[23-24]、種群生態(tài)學(xué)[25-26]和抗逆機(jī)理[27-28]等方面對檉柳開展了研究。隨著DNA標(biāo)記技術(shù)的普及，不同檉柳植物的群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究也被陸續(xù)報(bào)道。楊晴等[29]采用ISSR標(biāo)記調(diào)查了河北省秦皇島市檉柳種群的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，認(rèn)為該地區(qū)檉柳具有較高遺傳多樣性；溫月仙等[30]利用葉綠體和核基因序列對黃河流域甘蒙檉柳(Tamarixaustromongolica)開展了種群遺傳學(xué)研究，檢測到其葉綠體基因的遺傳多樣性低于核基因，遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，無明顯譜系地理結(jié)構(gòu)；蘇志豪等[31]利用7個(gè)SSR標(biāo)記鑒定出塔里木盆地的沙生檉柳(Tamarixtaklamakanensis)具有一定的遺傳多樣性，但種群的平均等位基因多樣性較低?？梢?，不同檉柳植物的群體遺傳特征因所處生境的氣候、水分、土壤等條件不同而表現(xiàn)出較大差異。

多枝檉柳(Tamarixramosissima)屬多年生灌木或小喬木，在檉柳屬植物的所有生境類型中均有分布，如荒漠、半荒漠、草原和濕地等，是西北干旱、半干旱區(qū)分布最廣泛的檉柳屬植物[26,32]。在潮濕河岸地帶，該植物的水分競爭能力和泌鹽能力極強(qiáng)，對草本植物的生長具有限制作用，易形成單優(yōu)勢種植物群落；在荒漠區(qū)，多枝檉柳通過根系的“提水作用”將水分從深層土壤和地下水輸送到淺層土壤，水分和養(yǎng)分富集形成“沃島效應(yīng)”，間接為荒漠區(qū)動植物提供了適宜棲息地，在生態(tài)系統(tǒng)和植物種質(zhì)資源多樣性維持上均具有重要價(jià)值[33]。由于氣候變化、過度開墾和開發(fā)、過度放牧等自然和人類活動干擾，中國西北地區(qū)環(huán)境不斷惡化、荒漠化加劇。黑河下游的額濟(jì)納綠洲是西北干旱區(qū)的主要天然綠洲，代表性植物群落有胡楊(Populuseuphratica)和檉柳(Tamarixspp.)等。其中，以檉柳及其為主的群落所占面積最大(70%以上)，尤以多枝檉柳(T.ramosissima)最多。20世紀(jì)60年代以來，進(jìn)入黑河下游的水量逐漸減少，導(dǎo)致了河流和濕地面積大量縮減，使額濟(jì)納綠洲荒漠化的進(jìn)程顯著加快，威脅著大量植物的生存和繁衍[34]。李森等[35]發(fā)現(xiàn)，人為活動影響是額濟(jì)納綠洲荒漠化的主導(dǎo)因素，如對黑河的過度開發(fā)和綠洲區(qū)的“三濫”活動。不幸的是，額濟(jì)納檉柳群落賴以生存的水資源均源于黑河及其補(bǔ)給的地下水，當(dāng)供水量不足時(shí)，其生境便開始衰退，演變?yōu)槁愕睾土魃?，最終荒漠化[36]?？梢姡瑱f柳群落的生存狀況關(guān)系到額濟(jì)納綠洲生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，是評價(jià)其健康與否的重要指標(biāo)。本研究以額濟(jì)納低海拔濕地的12個(gè)天然多枝檉柳種群為研究對象，利用EST-SSR標(biāo)記技術(shù)分析其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，旨在探明該地區(qū)多枝檉柳種質(zhì)資源的基本特征，為該區(qū)域的生態(tài)與環(huán)境保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

樣本于2019年8月采自內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善盟額濟(jì)納旗，選取12個(gè)野生多枝檉柳種群，每個(gè)種群采集24個(gè)長勢良好、無病蟲害個(gè)體的幼嫩葉片。采樣時(shí)，每個(gè)個(gè)體間隔5～10 m，采樣后置于變色硅膠中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。采樣位置的詳細(xì)地理信息見表1和圖1。

表1 多枝檉柳采樣點(diǎn)信息

圖1 多枝檉柳采樣點(diǎn)地理分布圖Fig.1 Geographic distribution of T. ramosissima

1.2 SSR標(biāo)記的多態(tài)性檢測

使用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，天根生化科技有限公司，北京)提取多枝檉柳基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)(Nano Drop 2000c，賽默飛世爾科技有限公司，馬薩諸塞州，美國)進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測，最終獲得191個(gè)合格的DNA樣本，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

本研究所用SSR分子標(biāo)記為本實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)所得的14個(gè)EST-SSR標(biāo)記(表2)。使用前在每個(gè)標(biāo)記的上游引物5′端加FAM、HEX或ROX熒光標(biāo)記，用于后期毛細(xì)管電泳檢測。以多枝檉柳DNA為模板，在ABI2720 PCR擴(kuò)增儀中采用25 μL混合反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：1 μL模板DNA(50 ng/μL)，12.5 μL Premix Taq(寶生物工程有限公司，大連)，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物和10.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，引物最佳退火溫度(50～60 ℃)30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托擎科生物科技有限公司(北京)在內(nèi)標(biāo)為GS500LIZ的ABI 3730 DNA分析儀(賽默飛世爾科技有限公司，馬薩諸塞州，美國)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。

表2 14個(gè)多態(tài)EST-SSR標(biāo)記的基本信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用GeneMarker V2.6.0(SoftGenetics，賓夕法尼亞州立大學(xué)，美國)對毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行矯正和等位基因判讀。用PowerMarker V3.0(http://www.powermarker.net/)分析各SSR的多態(tài)性信息含量(PIC)；利用GenAlEx V6.502(http://biology.anu.edu.au/GenAlEx)計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、種群間多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)、分子方差分析(AMOVA)、遺傳分化系數(shù)(Fst)、近交系數(shù)(Fis)和基因流(Nm)；利用PopGene V1.32(http://www.ualberta.ca/～fyeh/)統(tǒng)計(jì)Nei’s遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)。采用R包ecodist進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，分析群體遺傳距離與地理距離的相關(guān)性。

使用Structure V2.3(http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html)分析多枝檉柳的群體遺傳結(jié)構(gòu)。參數(shù)設(shè)置為：K為2～12，“Length of burnin period”為10 000，“Number of MCMC replications after burnin”為100 000，每個(gè)K值單獨(dú)運(yùn)行20次。結(jié)果上傳至Structure Harvester(http://taylor0.biology.ucla.edu/structure Harvester/)計(jì)算最佳K值?；赑opGene V1.32得到的群體間遺傳距離，利用FAMD V1.31(http://www.opensource.org/licenses/artistic-license-2.0.php)和MEGA V10.0.4(http://www.megasoftware.net)進(jìn)行PCoA分析和非加權(quán)配對法(UPGMA)聚類分析，并采用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR標(biāo)記的遺傳多樣性指數(shù)

14個(gè)EST-SSR標(biāo)記在191個(gè)多枝檉柳個(gè)體中共擴(kuò)增出79個(gè)等位基因(Na)，每個(gè)基因座上的等位基因數(shù)為3～7個(gè)(平均值為5.6)，期望雜合度(He)在0.18～0.77間(平均值為0.55)，觀測雜合度(Ho)在0.05～0.51范圍內(nèi)(平均值為0.29)，多態(tài)信息含量(PIC)在0.17～0.74間，平均值為0.51(表3)。

表3 14個(gè)多態(tài)EST-SSR標(biāo)記的遺傳參數(shù)

2.2 多枝檉柳種群的遺傳多樣性

各多枝檉柳種群的多態(tài)位點(diǎn)比率(P)平均值為0.970，期望雜合度(He)在0.368～0.565間(平均0.473)，觀察雜合度(Ho)在0.224～0.383間(平均0.294)，Shannon’s指數(shù)(I)在0.680～1.037間(平均0.862)，固定指數(shù)(F)在0.182～0.443間(平均0.332)。其中，pop2、pop3、pop5、pop6和pop12的Ne和He均較高，具有相對豐富的遺傳多樣性，而其余種群的Ne和He分別在1.830～2.160和0.368～0.470間，遺傳多樣性相對較低。各種群He、Ho以及I等遺傳參數(shù)變化不大，遺傳多樣性相似(表4)。

表4 12個(gè)多枝檉柳種群的遺傳多樣性

多枝檉柳種群內(nèi)的近交系數(shù)(Fis)為0.366，群體間平均基因流(Nm)為4.425，種群間平均遺傳分化系數(shù)(Fst)為0.079，各種群間的遺傳分化系數(shù)(Fst)見表5。AMOVA分析結(jié)果顯示，種群間遺傳變異為14.0%，種群內(nèi)遺傳變異為86.0%，與上述種群遺傳分化系數(shù)結(jié)果吻合(表6)。

表5 多枝檉柳種群間的遺傳分化系數(shù)(Fst)及Nei’s遺傳距離

表6 多枝檉柳種群間和種群內(nèi)分子變異的AMOVA分析

遺傳距離分析顯示(表5)， pop1、pop3和pop4的遺傳距離在0.063～0.075間； pop2、pop5、pop6和pop12的遺傳距離在0.034～0.061內(nèi)；pop7、pop8、pop9和pop10的遺傳距離在0.061～0.067間，而pop11與其他種群間的遺傳距離相對較遠(yuǎn)。

2.3 多枝檉柳的種群遺傳結(jié)構(gòu)

當(dāng)K為4時(shí)，ΔK最大(圖2,A)，說明191份多枝檉柳可分為4個(gè)亞群：即pop1、pop3和pop4為Ⅰ組，pop7、pop8、pop9和pop10為Ⅱ組，pop2、pop5、pop6和pop12為Ⅲ組、pop11為Ⅳ組(圖2,B)。

為進(jìn)一步分析多枝檉柳種群間的遺傳關(guān)系，利用12個(gè)種群間的Nei’s 遺傳距離進(jìn)行了UPGMA聚類分析(圖3，A)和主坐標(biāo)分析(PCoA)(圖3，B)。結(jié)果顯示，這些多枝檉柳種群均被分為4組：pop1、pop3和pop4為一組，pop2、pop5、pop6和pop12為一組，pop7、pop8、pop9和pop10為一組，pop11為一組，與遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。Mantel檢驗(yàn)表明各種群的遺傳距離和地理距離不具相關(guān)性(r=0.194，P=0.120，圖4)。

紅色代表pop2、pop5、pop6和pop12；綠色代表pop7、pop8、pop9和pop10；藍(lán)色代表pop1、pop3和pop4；黃色代表pop11圖2 多枝檉柳亞類群數(shù)確定(A)及遺傳結(jié)構(gòu)分析(B)Red represents pop2, pop5, pop6 and pop12; green represents pop7, pop8, pop9 and pop10; blue represents pop1, pop3 and pop4; yellow represents pop11Fig.2 Subpopulation identifying (A) and population genetic structure analysis (B) of T. ramosissima

比例尺對應(yīng)的是基于最大似然法的進(jìn)化距離圖3 基于遺傳距離的多枝檉柳種群的UPGMA聚類分析(A)和主坐標(biāo)分析(B)The scale bar corresponds to the evolutionary distance based on the Maximum Likelihood MethodFig.3 UPGMA dendrogram (A) and Principal Coordinates analysis (B) based on genetic distance of T. ramosissima populations

圖4 多枝檉柳種群的遺傳距離與地理距離的相關(guān)性分析Fig. 4 Correlation analysis between genetic distance and geographic distance of T. ramosissima populations

3 討 論

遺傳多樣性是衡量一個(gè)物種適應(yīng)環(huán)境變化的重要指標(biāo)，是物種生存和進(jìn)化的內(nèi)在基礎(chǔ)[37]。物種的適應(yīng)性與遺傳多樣性密切相關(guān)，即遺傳多樣性越高，適應(yīng)性越強(qiáng)[38-39]。本研究所用的14個(gè)SSR標(biāo)記雖位于多枝檉柳基因序列內(nèi)，但表現(xiàn)出中高度的多態(tài)性(平均He和平均Ho分別為0.55和0.29，平均PIC為0.51)，一定程度體現(xiàn)了這些種群遺傳變異信息豐富的特性。一般來說，一組等位基因的多態(tài)性百分率超過50%則說明它們具有相對豐富的遺傳多樣性[40-41]。蔣志敏等[42]利用ISSR標(biāo)記技術(shù)對黃河三角洲3個(gè)檉柳種群的90個(gè)個(gè)體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)10個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性比率為85%；趙景奎等[43]利用RAPD標(biāo)記技術(shù)分析了黃河三角洲3個(gè)天然檉柳群體的遺傳多樣性和遺傳分化，得到40.07%的多態(tài)百分比；葉春秀等[44]通過SSR標(biāo)記分析了新疆塔河流域上、中、下游檉柳的種質(zhì)資源遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)它們的多態(tài)性比率為79.49%。本研究發(fā)現(xiàn)，12個(gè)種群的平均多態(tài)位點(diǎn)比率為97.0%，表明額濟(jì)納濕地多枝檉柳種群具有豐富的遺傳變異。綜合Ne、He等種群遺傳參數(shù)來看，pop2、pop3、pop5、pop6和pop12的遺傳多樣性相對較高(He均大于0.5)，但所有種群的遺傳多樣性差別不大，暗示了它們中等水平遺傳多樣性的特征。

影響種群遺傳結(jié)構(gòu)的因素有繁育系統(tǒng)、地理分布、基因流等，其中基因流是種群遺傳結(jié)構(gòu)均質(zhì)化的關(guān)鍵因素，能有效減少種群間的遺傳變異[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，多枝檉柳群體間的平均基因流(Nm)為4.425，說明所調(diào)查種群間存在頻繁的基因交流，能有效減少遺傳漂變對這些種群的影響，避免了群體間的遺傳分化。固定指數(shù)(F)是衡量雜合子缺失或過剩的參數(shù)[46]。12個(gè)多枝檉柳種群的F值均大于0，表明它們處于雜合子缺失狀態(tài)，存在一定程度的近交現(xiàn)象[47]。當(dāng)然，這可能與本研究調(diào)查群體的地理距離相對較近有關(guān)。張娟等[38]對9個(gè)地理距離相對較遠(yuǎn)的新疆天然剛毛檉柳(Tamarixhispida)種群研究發(fā)現(xiàn)，可能因剛毛檉柳傳粉媒介(風(fēng)媒和蟲媒等)的傳播距離小，造成了采樣群體間的基因流障礙，故而檢測到群體間較高的分化程度。有趣的是，雖然基因流廣泛，但可能與其傳粉媒介的傳粉能力和繁殖方式有關(guān)，多枝檉柳種群內(nèi)的平均近交系數(shù)亦較高(Fis=0.366)。王仲禮等[39]和Bawa等[48]發(fā)現(xiàn)，檉柳的傳粉媒介是以小型蠅類和蜂類為主，兼有多種昆蟲傳粉；王仲禮等[39]和張娟等[38]發(fā)現(xiàn)檉柳的繁育方式為自交親和，但缺乏自花傳粉機(jī)制，不存在無融合生殖現(xiàn)象，為兼性異交。因此可推測，如果出現(xiàn)地理距離隔離或長期缺乏長距離傳粉者，會導(dǎo)致多枝檉柳遺傳多樣性下降，出現(xiàn)近交衰退現(xiàn)象。

群體遺傳結(jié)構(gòu)是遺傳變異在群體內(nèi)、群體間的分布以及在時(shí)間上的變化，研究群體遺傳結(jié)構(gòu)有助于種質(zhì)資源的保護(hù)、利用和改良[49-50]。本研究發(fā)現(xiàn)，12個(gè)多枝檉柳種群可劃分為4個(gè)亞群。一般來說，長壽和異交物種的遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，而自交物種的遺傳變異多發(fā)生在種群間[51]。12個(gè)多枝檉柳種群的平均遺傳分化系數(shù)(Fst)為0.079，說明在總遺傳變異中，7.9%來自種群間，92.1%來自種群內(nèi)，與AMOVA分析結(jié)果相似(14.0%-vs-86.0%)。這與其他檉柳科植物種群間的遺傳分化情況一致，如長葉紅砂(Reaumuriatrigyna)(Gst=0.1425)[45]、紅砂(Reaumuriasoongorica)(Gst=0.1931)[52]、疏花水柏枝(Myricarialaxiflora)(Gst=0.224)[53]等。蔣志敏[42]、趙景奎等[43]和葉春秀等[44]同樣發(fā)現(xiàn)檉柳的遺傳變異主要發(fā)生于種群內(nèi)部，而種群間遺傳分化程度相對較低。

多枝檉柳以耐干旱、耐鹽堿、繁殖迅速等特點(diǎn)，被視為阿拉善荒漠區(qū)的重要造林綠化樹種，是延緩綠洲荒漠化的重要防線，保持較高的遺傳多樣性是該植物遺傳資源保護(hù)與開發(fā)利用的核心。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管所調(diào)查的多枝檉柳種群具有較豐富的遺傳多樣性，但它們均呈現(xiàn)出一定程度的雜合子不足及近交現(xiàn)象，對該地區(qū)多枝檉柳遺傳多樣性的長期維持構(gòu)成了潛在不利影響。因此，在開發(fā)與利用該種質(zhì)資源的同時(shí)，應(yīng)考慮維持和創(chuàng)造多枝檉柳群體間的基因流動，盡量減少人類活動對其生存環(huán)境的干擾和破壞，保護(hù)和修復(fù)已受損的濕地生態(tài)系統(tǒng)。