異化鐵還原菌介導(dǎo)的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程

張相杰，陳國俊，李涵，李芳柏，劉同旭

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510650；2.廣東省科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境與土壤研究所；華南土壤污染控制與修復(fù)國家地方聯(lián)合工程研究中心；廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510650)

鐵是地殼中第四豐富的元素，也是生物圈中最普遍存在的氧化還原活性金屬[1]。鐵長期以來被認(rèn)為是生命所必須的，鐵氧化菌(FeOB)與鐵還原菌(FeRB)驅(qū)動(dòng)了鐵的生物地球化學(xué)循環(huán)。鐵循環(huán)過程控制著土壤有機(jī)物礦化、甲烷排放、重金屬的吸附固定、反硝化等環(huán)境過程，是連接土壤養(yǎng)分循環(huán)與污染物轉(zhuǎn)化的紐帶，是推動(dòng)物質(zhì)循環(huán)與能量代謝的重要引擎[2-6]。氮是核苷酸和氨基酸的基本組成元素，是構(gòu)成生命的基本元素，從根本上影響著大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[7]。硝酸鹽作為氮循環(huán)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在自然界氮循環(huán)過程中起著至關(guān)重要的作用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，氮素的輸入至關(guān)重要，而微生物的反硝化作用會(huì)導(dǎo)致氮素的大量流失[8]。微生物通過反硝化過程、異化硝酸鹽還原成銨、厭氧氨氧化競爭性還原硝酸鹽[9]。硝酸鹽還原的產(chǎn)物N2O作為重要的溫室氣體，超過60%的排放來自農(nóng)業(yè)土壤，而土壤中超過2/3的N2O排放可歸因于細(xì)菌和真菌生物與非生物反硝化過程共同作用的結(jié)果[10-11]。因此，微生物驅(qū)動(dòng)的硝酸鹽還原過程對元素地球化學(xué)循環(huán)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、溫室氣體排放等方面具有重要意義。

筆者選取發(fā)酵型和呼吸型兩種鐵還原菌作為模式菌株，研究其驅(qū)動(dòng)NRFO過程。設(shè)置不同鐵還原微生物驅(qū)動(dòng)NRFO過程的對照實(shí)驗(yàn)，對反應(yīng)物和生成物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析，對不同處理組的次生礦物進(jìn)行對比，研究目的包括：探究不同類型鐵還原菌、硝酸鹽還原菌的NRFO過程動(dòng)力學(xué)和礦物學(xué)差異，揭示鐵還原菌驅(qū)動(dòng)的NRFO過程的反應(yīng)機(jī)制和影響因素。該研究可拓展NRFO過程的微生物范疇，揭示厭氧環(huán)境微生物驅(qū)動(dòng)的NRFO過程中的微生物功能與貢獻(xiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用的微生物為發(fā)酵型兼性厭氧鐵還原菌KlebsiellapneumoniaeL17[46]、呼吸型兼性厭氧鐵還原菌ShewanellaoneidensisMR-1[47]，來自海洋微生物菌種保藏管理中心(Marine Culture Collection of China, MCCC)；呼吸型兼性厭氧鐵還原菌Shewanellaputrefaciensstrain CN32[48]，來自廣東省微生物菌種保藏中心(Guangdong Microbial Culture Collection Center, GDMCC)。好氧培養(yǎng)基成分為NaCl 5 g/L、牛肉浸膏5 g/L、蛋白胨10 g/L，pH值調(diào)至7.0，并對培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌處理。將-80 ℃冰箱中保存的微生物(1 mL)取出解凍后，在超凈工作臺(tái)倒入好氧培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)14 h(30 ℃，180 r/min)，然后放置在超凈工作臺(tái)，取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到好氧培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 h(30 ℃，180 r/min)。對100 mL西林瓶、純水用100% N2充氣30 min排氧，并高溫高壓滅菌，然后在厭氧工作站中配制亞鐵母液(FeSO41 mol/L)，用橡膠塞壓緊并用鋁蓋進(jìn)一步密封，平衡24 h后，用0.22 μm濾頭過濾并進(jìn)行避光保存。配制葡萄糖母液(1 mol/L)、乳酸鹽母液(1 mol/L)，并用0.22 μm濾頭過濾，然后用100% N2充氣30 min排氧。微量元素儲(chǔ)備液SL14和維生素儲(chǔ)備液V10的具體配方參考文獻(xiàn)[49]，用0.22 μm濾頭過濾之后，再用100% N2充氣30 min排氧。配制30 mmol/L的哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)作為洗菌和實(shí)驗(yàn)體系的緩沖液(pH=7.0)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案及測試方法

表1 不同鐵還原菌、不同亞鐵濃度的處理組

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 硝酸鹽還原動(dòng)力學(xué)

不同亞鐵濃度條件下，3種異化鐵還原菌的硝酸鹽還原動(dòng)力學(xué)曲線見圖1，3種異化鐵還原菌的硝酸鹽還原準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)見表2。結(jié)果表明，不加亞鐵情況下，L17和CN32體系的硝酸鹽在1.6 d時(shí)被完全還原，硝酸鹽還原的準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)分別為1.772、1.672/d(表2)，說明L17和CN32的硝酸還原能力接近。MR-1體系與L17和CN32不同，在0～16 h硝酸鹽迅速還原，在16～64 h硝酸鹽還原速率變慢，在第3天，硝酸鹽被完全還原。硝酸鹽還原準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)0.674/d，顯著低于L17和CN32。分別在體系中添加1、5 mmol/L亞鐵，結(jié)果顯示，硝酸鹽的還原均受到顯著抑制。亞鐵為1 mmol/L條件下，微生物硝酸鹽還原速率明顯高于高濃度亞鐵條件，反應(yīng)在第7天已達(dá)到穩(wěn)定，L17菌在第7天將硝酸鹽完全還原；CN32體系的硝酸鹽在第4天基本被還原；說明低濃度亞鐵抑制了L17、CN-32硝酸鹽還原速率，但硝酸鹽最終能被完全還原。在MR-1體系，初始階段硝酸鹽還原速率較快，之后迅速達(dá)到平衡，硝酸鹽被還原30%，說明低濃度亞鐵顯著的抑制了MR-1硝酸鹽還原過程。綜上所述，在低濃度亞鐵條件下，微生物硝酸鹽還原速率為CN32(0.563/d)>L17(0.179/d)>MR-1(0.034/d)。在高濃度5 mmol/L亞鐵條件下，L17處理組僅僅有0.7 mmol/L硝酸鹽被還原，CN32處理組在反應(yīng)12 d后，1 mmol/L硝酸鹽被還原，MR-1處理組在反應(yīng)12 d后，1.6 mmol/L硝酸鹽被還原，其準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)分別為0.010/d、0.014/d、0.010/d，顯著低于1 mmol/L亞鐵處理以及不加亞鐵的處理。3種菌在高濃度亞鐵條件下，反應(yīng)前期少量的硝酸鹽被還原，之后硝酸鹽還原過程停滯，表明了高濃度亞鐵對微生物硝酸鹽還原具有顯著的抑制作用。綜上所述，亞鐵的添加抑制了微生物硝酸鹽還原過程，而隨著亞鐵濃度的升高，對微生物還原硝酸鹽的抑制作用增強(qiáng)，亞鐵對不同類型鐵還原微生物硝酸鹽還原的抑制程度存在差異。

表2 硝酸鹽還原亞鐵氧化過程中亞鐵氧化和硝酸鹽還原的準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)

圖1 異化鐵還原菌的硝酸鹽還原反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

2.2 亞硝酸鹽和銨根生成動(dòng)力學(xué)

圖2 不同亞鐵濃度條件下異化鐵還原菌的亞硝酸鹽生成、銨根生成反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

2.3 亞鐵氧化動(dòng)力學(xué)

亞鐵氧化動(dòng)力學(xué)如圖3所示。在未添加硝酸鹽的條件下，L17、CN32和MR-1均不能生物氧化亞鐵；而加入硝酸鹽后，在1、5 mmol/L Fe2+的體系中均發(fā)生了氧化，在厭氧無催化劑存在的條件下，亞鐵和硝酸鹽不能直接發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[31, 51]。說明鐵還原條件下的亞鐵氧化是由硝酸鹽還原導(dǎo)致的。對于1 mmol/L Fe2+，在L17體系中，亞鐵在第4天接近完全氧化；CN32體系亞鐵完全氧化耗時(shí)6 d；MR-1體系中，直到第7天亞鐵僅氧化14.4%。其準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)分別為L17(0.066/d)、CN32(0.051/d)、MR-1(0.034/d)(表2)。在5 mmol/L Fe2+條件下，第12天L17、CN32、MR-1體系中分別有57.1%、51.4%、34.1%的亞鐵發(fā)生氧化，其準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)分別為L17(0.066/d)、CN32(0.051/d)、MR-1(0.034/d)。上述結(jié)果表明，3種鐵還原菌的亞鐵氧化速率為L17>CN32>MR-1，亞鐵氧化速率不同的原因是，不同微生物的硝酸鹽還原速率的差異以及代謝途徑的不同。在L17和CN32體系中，高濃度亞鐵不完全氧化，但低濃度亞鐵可以完全氧化；MR-1在不同的亞鐵濃度下均表現(xiàn)為亞鐵的不完全氧化。

圖3 不同亞鐵濃度條件下鐵還原微生物的亞鐵氧化動(dòng)力學(xué)曲線

2.4 次生礦物表征

亞硝酸鹽與亞鐵化學(xué)反硝化作用生成的次生礦物分為3部分，一部分沉淀于細(xì)胞周圍環(huán)境(綠色箭頭所示)，一部分粘附在細(xì)胞表面但結(jié)合并不緊密(藍(lán)色箭頭所示)；一部分沉淀生成在細(xì)胞表面或者外膜，形成細(xì)胞結(jié)殼(紅色箭頭所示)。如圖4所示。

圖4 高濃度亞鐵條件下硝酸鹽還原亞鐵氧化過程生成礦物的SEM結(jié)果(菌濃度OD600=1.0；硝酸鹽初始濃度5 mmol/L)

在Fe2+濃度為5 mmol/L的條件下，次生礦物大量附著在細(xì)胞表面，3種微生物均發(fā)生了明顯的細(xì)胞結(jié)殼，導(dǎo)致在高濃度亞鐵條件下硝酸鹽還原速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于低濃度亞鐵濃度。在Fe2+濃度為1 mmol/L條件下，如圖5所示。

圖5 低濃度亞鐵條件下硝酸鹽還原亞鐵氧化過程生成礦物的SEM結(jié)果(菌濃度OD600=1.0；硝酸鹽初始濃度5 mmol/L)

L17和CN32亞鐵氧化生成鐵氧化物并沉淀在細(xì)胞表面，會(huì)阻礙硝酸鹽進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)進(jìn)行還原。然而，大部分微生物沒有結(jié)殼，所以，在反應(yīng)后期，硝酸鹽仍然能被完全還原；而且L17細(xì)胞表面沉淀的次生礦物明顯多于CN32，導(dǎo)致L17硝酸鹽還原速率明顯低于CN32。低濃度亞鐵條件下，MR-1處理組亞鐵幾乎沒有被氧化，所以，未收集到次生礦物，這可能是因?yàn)閬嗚F的添加導(dǎo)致了細(xì)胞活性降低，從而抑制了硝酸鹽還原過程。同時(shí)，對次生礦物類型進(jìn)行了XRD表征，如圖6所示，結(jié)果表明，在高濃度亞鐵條件下，3種鐵還原微生物處理組生成的結(jié)晶態(tài)礦物主要為針鐵礦。亞鐵與亞硝酸鹽化學(xué)反應(yīng)生成的鐵氧化物主要為針鐵礦和纖鐵礦[50]。在低濃度亞鐵條件下，生成的鐵氧化物除了針鐵礦之外，還生成了結(jié)晶度較差的水鐵礦，說明亞鐵氧化成礦的結(jié)晶度與亞鐵濃度正相關(guān)。

圖6 不同亞鐵濃度下硝酸鹽還原亞鐵氧化生成礦物的XRD圖譜(菌濃度OD600=1.0；硝酸鹽初始濃度5 mmol/L)

綜上所述，亞鐵氧化成礦并附著在細(xì)胞表面，能影響微生物硝酸鹽還原。隨著亞鐵濃度的提高，細(xì)胞結(jié)殼逐漸增加，次生礦物結(jié)晶度提高，阻礙硝酸鹽進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)進(jìn)行還原，導(dǎo)致了硝酸鹽還原速率明顯降低甚至完全停滯，從而抑制了微生物的代謝活動(dòng)[52]。

2.5 反應(yīng)機(jī)制與環(huán)境意義

圖7 異化鐵還原菌介導(dǎo)的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程機(jī)制

鐵還原菌還原鐵主要通過3種途徑：鐵還原菌與鐵氧化物直接接觸；細(xì)胞分泌胞外螯合物提高鐵礦物溶解性，促進(jìn)鐵還原過程；細(xì)胞分泌或者利用周圍環(huán)境的電子穿梭體，通過胞外電子傳遞過程進(jìn)行鐵還原[57]。鐵還原菌介導(dǎo)的Fe-N循環(huán)已有報(bào)道，鐵氧化物作為電子受體被微生物還原為亞鐵，亞鐵被亞硝酸鹽化學(xué)氧化，生成的鐵氧化物仍然能夠作為鐵還原菌的電子受體被還原，實(shí)現(xiàn)鐵的氧化還原循環(huán)。對于亞硝酸鹽來說，一方面被亞鐵化學(xué)還原，另一方面能夠作為微生物的電子受體，被生物還原[58-59]。說明鐵還原菌介導(dǎo)的鐵氧化還原循環(huán)和硝酸鹽的持續(xù)還原理論上可行。但研究當(dāng)中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的鐵還原過程，其主要原因可能是：1)細(xì)胞結(jié)殼一方面限制微生物的運(yùn)動(dòng)、生長和營養(yǎng)物的攝入，導(dǎo)致微生物鐵還原相關(guān)酶活性的降低，阻礙鐵還原菌胞外電子傳遞。另一方面微生物不能有效地利用細(xì)胞表面鐵氧化物作為電子受體[36, 60]。2)硝酸鹽還原過程抑制了鐵還原過程。目前的研究表明，細(xì)胞色素CymA能夠參與多種電子受體的還原過程，微生物更傾向于利用硝酸鹽作為電子受體，所以硝酸鹽還原CymA的電子傳遞過程可能導(dǎo)致鐵還原速率的減慢，表現(xiàn)為硝酸鹽和鐵的競爭性還原[44, 61]。3)由于較高濃度亞硝酸鹽的存在，導(dǎo)致鐵還原生成亞鐵發(fā)生再氧化。4)體系殘留的亞鐵吸附在鐵氧化物表面，導(dǎo)致鐵活性的降低，微生物無法進(jìn)行生物鐵還原過程。

研究表明，厭氧環(huán)境中多種微生物群落參與NRFO過程[62]。本研究強(qiáng)調(diào)了在厭氧富鐵環(huán)境中非模式菌驅(qū)動(dòng)的NRFO過程，表明在厭氧環(huán)境中NRFO過程并不是單一微生物驅(qū)動(dòng)的，非亞鐵氧化功能菌也能夠驅(qū)動(dòng)NRFO過程。在低氮肥施加水稻土和厭氧沉積物中，微生物硝酸鹽異化還原為銨(DNRA)在硝酸鹽代謝途徑中占有主導(dǎo)地位[63-64]。鐵還原菌DNRA生成銨根，然后被植物或者其他微生物吸收利用，有利于厭氧環(huán)境氮沉積和再循環(huán)。厭氧富鐵環(huán)境中亞鐵顯著抑制微生物DNRA過程，亞鐵競爭性還原亞硝酸鹽導(dǎo)致微生物產(chǎn)銨的大量減少，生成的NO和N2O釋放到大氣中，造成厭氧環(huán)境中氮損耗[39]。細(xì)胞結(jié)殼阻礙硝酸鹽等電子受體進(jìn)入細(xì)胞還原，導(dǎo)致硝酸鹽的不完全還原，同時(shí)限制微生物的運(yùn)動(dòng)、生長、營養(yǎng)物質(zhì)攝入[60]。該研究表明，細(xì)胞結(jié)殼抑制了異化鐵還原菌介導(dǎo)的NRFO過程，細(xì)胞結(jié)殼對不同鐵還原菌的抑制機(jī)制不同。本工作豐富了硝酸鹽還原亞鐵氧化的研究思路，加深了對微生物驅(qū)動(dòng)的NRFO反應(yīng)機(jī)制的理解。

3 結(jié)論

鐵還原菌能夠通過硝酸鹽還原的中間產(chǎn)物亞硝酸鹽與亞鐵的化學(xué)反硝化作用實(shí)現(xiàn)亞鐵氧化過程。亞鐵抑制了微生物硝酸鹽還原、亞硝酸鹽和銨根的生成。低濃度亞鐵條件下，亞鐵降低了L17和CN32硝酸鹽還原速率，而亞鐵完全抑制了MR-1硝酸鹽還原，其抑制順序?yàn)镸R-1>L17>CN32。亞鐵嚴(yán)重抑制了硝酸鹽異化還原成銨過程。在高濃度亞鐵條件下，亞鐵氧化成礦明顯抑制了微生物硝酸鹽還原過程。在低濃度亞鐵條件下，對于L17和CN32來說，亞鐵氧化生成的鐵氧化物抑制了微生物的硝酸鹽還原，但大部分微生物沒有完全結(jié)殼，所以，硝酸鹽最終能被完全還原，且CN32硝酸鹽還原速率明顯高于L17。亞鐵毒害作用抑制了L17硝酸鹽還原過程，也是影響MR-1硝酸鹽還原的主要原因。隨著亞鐵濃度的升高，微生物細(xì)胞結(jié)殼程度越高，細(xì)胞的完全結(jié)殼是硝酸鹽還原停滯的主要原因。本研究拓展了硝酸鹽還原亞鐵氧化過程的微生物類型，加深了對微生物介導(dǎo)的硝酸鹽還原亞鐵氧化的理解，對研究微生物介導(dǎo)的鐵-氮循環(huán)過程具有重要的意義。