許 靜，李 晶，陶貴榮

西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065

鳳眼蓮Eichhorniacrassipes(Mart.)Solms又稱水葫蘆、鳳眼藍(lán)、布袋蓮，屬于單子葉雨久花科鳳眼蓮屬，是一種原產(chǎn)于南美洲亞馬遜流域的多年生飄浮型水生植物，是已知生長(zhǎng)繁殖速度最快的植物之一，目前在我國(guó)南方10多個(gè)省份都有分布，且極有可能向北方地區(qū)蔓延(鄭志鑫等，2018; Jonesetal.,2018; Zhangetal.,2010)。由于鳳眼蓮生長(zhǎng)繁殖快且天敵很少，已在很多地方造成嚴(yán)重的生態(tài)入侵問題，但鳳眼蓮又具備凈化污染水體、可用作發(fā)酵底料等優(yōu)點(diǎn)，因此，需要科學(xué)防控和合理利用鳳眼蓮(丁建清等,1995; 徐寸發(fā)等,2018; Aboul-Eneinetal.,2011; Sharmaetal.,2016; Yanetal.,2017)。成熟的鳳眼蓮植株有8～12片基生葉，合軸生長(zhǎng)，葉片深綠色，呈腎圓形，須根發(fā)達(dá)，葉柄中下部中空膨大成葫蘆狀，植株可以漂浮于水面(Penfound & Earle,1948)。鳳眼蓮形態(tài)具有較高可塑性，如植株密度過大時(shí)，膨大莖會(huì)消失，葉柄呈細(xì)直狀，高溫或低光照強(qiáng)度會(huì)造成葉柄增長(zhǎng)，葉片形狀也會(huì)受一些環(huán)境因子調(diào)控有所變化(高雷和李博，2004)。鳳眼蓮的繁殖分為有性和無性繁殖，但因鳳眼蓮的種子非常細(xì)小，在自然狀態(tài)下萌發(fā)率很低，造成其有性繁殖效率低下，因此，鳳眼蓮主要依靠產(chǎn)生克隆株的方式進(jìn)行無性繁殖(張迎穎等，2012)。Watson(1984)曾提出鳳眼蓮葉基長(zhǎng)出腋芽并發(fā)育成克隆株，克隆株與母株以匍匐莖相連，匍匐莖極易受外力影響折斷，克隆株即可脫離母株成為一個(gè)獨(dú)立的植株并漂浮到其他水域。

植物激素在植物整個(gè)生活史中都起到重要的調(diào)控作用。雖然鳳眼蓮具備生態(tài)學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)雙重重要性，但關(guān)于其生長(zhǎng)發(fā)育和克隆繁殖調(diào)控的研究，尤其是激素對(duì)其的調(diào)控研究甚少(Villamagna & Murphy,2010)。目前已知人工合成的生長(zhǎng)素2,4-D 對(duì)鳳眼蓮有一定的毒性，可作為鳳眼蓮的除草劑使用，而另一種生物源的生長(zhǎng)素吲哚乙酸和細(xì)胞分裂素在鳳眼蓮腋芽?jī)?nèi)的比值與其克隆株的生長(zhǎng)有相關(guān)性，且赤霉素被發(fā)現(xiàn)可以協(xié)同促進(jìn)2,4-D 對(duì)鳳眼蓮的毒殺作用(牛佳等，2012; Pieterse & Roorda,1982)。赤霉素最早被發(fā)現(xiàn)是因赤霉菌Gibberellafujikuroi分泌的一種雙萜類化學(xué)物質(zhì)造成水稻OryzasativaL.莖徒長(zhǎng)的癥狀，導(dǎo)致水稻惡苗病。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素在高等植物中普遍存在，并在植物的整個(gè)生活期都有重要調(diào)控作用(高秀華和傅向東，2018)。Pieterseetal.(1976)發(fā)現(xiàn)低濃度(0.1444～2.8871 μmol·L-1)的赤霉素會(huì)造成鳳眼蓮膨大莖消失，葉柄直立細(xì)長(zhǎng)，且克隆株的生長(zhǎng)受到抑制。相似的，Watsonetal.(1982)在廣口瓶里用添加了不同濃度(0.2887～2.8871 μmol·L-1)赤霉素的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)鳳眼蓮幼苗，發(fā)現(xiàn)赤霉素會(huì)造成鳳眼蓮葉柄成細(xì)直狀，膨大莖消失，但該研究結(jié)果顯示，低濃度的赤霉素會(huì)促進(jìn)鳳眼蓮產(chǎn)生更多的克隆株。這些結(jié)果說明，赤霉素對(duì)鳳眼蓮的生長(zhǎng)和無性繁殖均存在一定調(diào)控作用，但這些研究觀察檢測(cè)的生理指標(biāo)并不全面，而且使用的赤霉素濃度均較低，對(duì)于調(diào)控的克隆株結(jié)論也不一致。鑒于植物激素存在濃度依賴性，同一種激素在高濃度和低濃度時(shí)對(duì)植物的調(diào)控作用并不相同(De vleesschauweretal.,2014)，所以，這些結(jié)果并不能完全呈現(xiàn)出赤霉素對(duì)鳳眼蓮營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和克隆繁殖的調(diào)控作用。因此，本研究通過對(duì)鳳眼蓮?fù)庠词┯幂^高濃度的赤霉素，并檢測(cè)其形態(tài)指標(biāo)，包括株高、根長(zhǎng)和膨大莖周長(zhǎng)，葉片的長(zhǎng)寬和形態(tài)、葉片SPAD值以及莖上組織根重量和根重、根冠比，克隆株數(shù)量等指標(biāo)，以明確高濃度赤霉素對(duì)鳳眼蓮營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和克隆繁殖的影響及調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鳳眼蓮植株取自江西貴溪信江流域，將鳳眼蓮植株置于溫度(20±5)℃、濕度70%的溫室中，自然光照條件下，培養(yǎng)擴(kuò)繁得到大量來源同一母株的克隆株系，將新長(zhǎng)出的有5～6片葉的小克隆株從母株剝離，作為本研究的試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鳳眼蓮的培養(yǎng) 將鳳眼蓮植株置于40 cm×32 cm×12 cm的塑料盆中，用改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液[KNO3、NH4H2PO4、NH4Cl、MgSO4、Ca(NO3)2、FeSO4、EDTA、CuSO4、ZnSO4、H3BO4、MnCl2和(NH4)6Mo7O24濃度分別為1、0.25、0.1、0.5、1、0.025、0.025、0.0003、0.00033、0.0115、0.0035和0.0001 mmol·L-1]進(jìn)行培養(yǎng)，每盆4株，每盆裝5 L營(yíng)養(yǎng)液，每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液。

1.2.2 激素的施用 本研究施用的激素為赤霉酸(gibberellic acid, GA3)。用天平稱取0.6925 g GA3粉末，滴入幾滴乙醇溶解后加蒸餾水定容至20 mL配制成100 mmol·L-1的母液，用0.22 μm過濾器滅菌后置于-20 ℃保存，使用時(shí)吸取定量的母液用無菌水稀釋成50 μmol·L-1工作液，每盆用40 mL稀釋后的激素均勻噴灑在植株的莖葉表面，以噴灑無菌水為對(duì)照，每周噴灑一次直至收樣。

1.2.3 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 培養(yǎng)4周后，測(cè)量植株的株高、根長(zhǎng)、膨大莖直徑、葉片數(shù)量、葉片的長(zhǎng)和寬、葉片SPAD值和氮含量。其中，測(cè)量膨大莖直徑時(shí)每株選取3片最年幼的已經(jīng)發(fā)育成熟葉片的葉柄最粗部位進(jìn)行測(cè)量，并測(cè)定這3片葉片的長(zhǎng)寬、SPAD值和氮含量。測(cè)定生物量時(shí)，先取出植株晾干至表面無明顯水分，再稱重。

1.2.4 無性繁殖指標(biāo)的測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束后，清點(diǎn)每株鳳眼蓮上克隆株數(shù)量并用尺子測(cè)量匍匐莖長(zhǎng)度。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究中試驗(yàn)重復(fù)2次，每次試驗(yàn)每個(gè)處理3盆，每盆4株植物。使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表制作，采用T-test方法檢驗(yàn)處理間差異是否顯著，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素對(duì)鳳眼蓮植株形態(tài)的影響

如圖1所示，與噴灑無菌水的對(duì)照相比，外源噴灑50 μmol·L-1GA3的鳳眼蓮葉柄明顯增長(zhǎng)，整體株高為對(duì)照組的2倍多，根系也明顯變短，膨大莖周長(zhǎng)遠(yuǎn)小于對(duì)照組，基本不膨大。這些結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的低濃度赤霉素對(duì)鳳眼蓮植株形態(tài)的調(diào)控結(jié)果相符(Pieterseetal.,1976; Watsonetal.,1982)，說明本研究的高濃度激素處理有效，且高濃度與低濃度處理對(duì)鳳眼蓮植株形態(tài)的影響基本一致。GA3處理對(duì)鳳眼蓮葉片數(shù)量不產(chǎn)生明顯作用(表1)。

表1 赤霉素對(duì)鳳眼蓮形態(tài)相關(guān)指標(biāo)的影響

圖1 不同處理下鳳眼蓮植株的形態(tài)

2.2 赤霉素對(duì)鳳眼蓮葉片發(fā)育的影響

如圖2所示，正常情況下，鳳眼蓮的葉片呈腎圓形，顏色為深綠色，而50 μmol·L-1GA3處理后的葉片呈心形，雖然葉片長(zhǎng)度基本不變，但寬度變窄，葉片整體面積變小，且顏色由深綠變?yōu)闇\綠。葉片SPAD值和氮含量的測(cè)定結(jié)果(表2)表明，50 μmol·L-1GA3處理后的葉片SPAD值和氮含量均顯著低于對(duì)照組。這些結(jié)果說明赤霉素抑制了鳳眼蓮葉片的發(fā)育。

圖2 不同處理下鳳眼蓮葉片的形態(tài)

表2 赤霉素對(duì)鳳眼蓮葉片生長(zhǎng)的影響

2.3 赤霉素對(duì)鳳眼蓮生物量累積的影響

從表3可知，50 μmol·L-1GA3處理下鳳眼蓮的根系和莖上組織都顯著低于對(duì)照組，但根冠比無明顯差異，說明赤霉素抑制了鳳眼蓮生物量的累積，但對(duì)生物量在莖上組織和根系之間的分配無明顯作用。

表3 赤霉素對(duì)鳳眼蓮生物量累積的影響

2.4 赤霉素對(duì)鳳眼蓮克隆繁殖的影響

由表4可知，對(duì)照組在第3周開始出現(xiàn)克隆株，平均每株克隆株數(shù)為0.5個(gè)，到第4周基本每株都有1個(gè)克隆株，克隆株與母株相連的匍匐莖平均長(zhǎng)度為5.36 cm；而50 μmol·L-1GA3處理下的鳳眼蓮直到第4周仍未出現(xiàn)發(fā)育成熟的克隆株，說明赤霉素對(duì)鳳眼蓮克隆株產(chǎn)生有顯著抑制作用。

表4 赤霉素對(duì)鳳眼蓮產(chǎn)生克隆株的影響

3 討論

內(nèi)源赤霉素含量的增加或外源施用赤霉素都會(huì)造成植物莖或葉柄增長(zhǎng)，從而使株高增高，而赤霉素合成突變體植物一般出現(xiàn)矮小表型(高秀華和傅向東，2018)。Pieterseetal.(1976)和Watsonetal.(1982)的研究均表明，低濃度赤霉素促進(jìn)鳳眼蓮葉柄的縱向生長(zhǎng)，抑制膨大莖的發(fā)育。本研究使用高濃度的赤霉素出現(xiàn)了同樣的表型：葉柄增長(zhǎng)，膨大莖消失。這一結(jié)果說明，無論赤霉素濃度高低，都能造成鳳眼蓮葉柄細(xì)直且縱向增長(zhǎng)，最終出現(xiàn)株高增高的表型特征。除了對(duì)株高的調(diào)控外，赤霉素對(duì)葉片發(fā)育也有重要調(diào)控作用，但作用因植物種類而異。首先，赤霉素可改變植物葉片形態(tài)，如番茄LycopersiconesculentumMill.葉片經(jīng)赤霉素處理后葉緣由鋸齒狀變光滑，而胡椒PipernigrumL.葉片的葉面則由光滑變粗糙(Gray,1957)。本研究表明，葉面噴灑高濃度赤霉素使鳳眼蓮葉片形狀從腎圓形變?yōu)樾男?，說明赤霉素同樣對(duì)鳳眼蓮葉片的形狀有重要影響。其次，赤霉素還能影響葉片的長(zhǎng)寬和葉面積，如大豆Glycinemax(Linn.)Merr.和豌豆PisumsativumL.等植物葉片的長(zhǎng)度都會(huì)因赤霉素處理變長(zhǎng)，而水稻等單子葉植物的葉片除了長(zhǎng)度變長(zhǎng)外，其寬度還有可能變窄，但葉片的葉面積整體變大(Brain,1959; Gray,1957; Wheeler & Humphries,1964)。對(duì)同為單子葉植物的鳳眼蓮而言，赤霉素確實(shí)使葉片寬度變窄，但長(zhǎng)度基本沒有變化，所以整體葉面積變小。由于植物葉片基部有分生組織，赤霉素可通過促進(jìn)細(xì)胞分裂或增加細(xì)胞長(zhǎng)度而造成葉片伸長(zhǎng)(Brain,1959; Gonzaleetal.,2012; Nelissenetal.,2012)，但是鳳眼蓮葉片基部連接的是膨大莖，膨大莖下方才有分生組織，這也是赤霉素可以促進(jìn)鳳眼蓮莖伸長(zhǎng)而不是葉片伸長(zhǎng)的原因。此外，赤霉素對(duì)葉片顏色也有影響。赤霉素下游信號(hào)重要調(diào)控因子DELLA的突變體植株顏色比野生型更加深綠(Pengetal.,1997)，而外源施用赤霉素的植物葉片綠色更淺(Kuraishi & Hashimoto,1957)。同樣的，本研究表明，施用赤霉素使鳳眼蓮葉片顏色更淺，SPAD值和氮含量更低。目前，關(guān)于赤霉素信號(hào)通路對(duì)葉綠素生物合成的調(diào)控機(jī)制已基本明確，DELLA通過與 SCL(scarecrow-like)蛋白的結(jié)合解除了SCL對(duì)抑制原葉綠素酸脂氧化還原酶編碼基因PORC表達(dá)的抑制作用，從而促進(jìn)了葉綠素的合成。因此，外源赤霉素通過抑制DELLA的累積實(shí)現(xiàn)了對(duì)葉綠素合成的抑制(Maetal.,2014)。

赤霉素對(duì)植物生物量的影響因植物種類而異，目前并沒有一致的結(jié)論。本研究結(jié)果表明，經(jīng)赤霉素處理的鳳眼蓮雖然根冠比與對(duì)照無差別，但莖上組織鮮重和根鮮重均低于對(duì)照組，說明赤霉素對(duì)鳳眼蓮生物量的累積起抑制作用，這可能是以下幾個(gè)原因造成的：一是赤霉素抑制了鳳眼蓮葉片的發(fā)育，造成其葉面積減小和葉綠素含量減少，從而降低了光合作用效率并最終使得生物量累積速度減慢；二是赤霉素抑制了鳳眼蓮克隆株的產(chǎn)生，由于本研究計(jì)算的重量包括了母株和克隆株的重量，因此赤霉素處理的植株的重量遠(yuǎn)低于對(duì)照植株的重量；三是由于赤霉素處理過的鳳眼蓮植株沒有膨大莖，造成植株不能正常浮于水面，而是部分莖葉沉入水中并最終潰爛，因此損失了部分重量。

本研究結(jié)果表明，赤霉素處理顯著抑制了鳳眼蓮的克隆株產(chǎn)生，這與Pieterseetal.(1976)的研究結(jié)果一致，但和Watsonetal.(1982)的結(jié)論剛好相反。Watsonetal.(1982)研究中提到赤霉素對(duì)鳳眼蓮克隆株產(chǎn)生的調(diào)控存在濃度依賴性，濃度在1.4435 μmol·L-1時(shí)對(duì)鳳眼蓮克隆株產(chǎn)生的促進(jìn)作用最強(qiáng)，在其試驗(yàn)的最高濃度2.8871 μmol·L-1時(shí)促進(jìn)作用開始減弱，但Pieterseetal.(1976)的研究中赤霉素濃度同樣為低濃度(0.2887～2.8871 μmol·L-1)，而本研究參考了同為單子葉的模式植物水稻中赤霉素常用的外源噴灑濃度50 μmol·L-1(De vleesschauweretal.,2016)，約為另外2個(gè)研究中最高濃度的17.3倍?？梢姡狙芯颗c另外2個(gè)研究中使用的赤霉素濃度的差異不太可能是造成不同研究中赤霉素對(duì)克隆株產(chǎn)生的調(diào)控作用不一致的原因，真正的原因可能是植株培養(yǎng)方式和激素施用方法的不同。在Pieterseetal.(1976)和本研究中，鳳眼蓮的培養(yǎng)都是模擬自然條件，將植株置于寬闊的塑料盆中用液體營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，由于赤霉素處理使得鳳眼蓮膨大莖消失，植株無法正常浮于水面，新發(fā)的腋芽一直泡在營(yíng)養(yǎng)液中，也極有可能導(dǎo)致其無法正常發(fā)育成成熟的克隆株，而Watsonetal.(1982)是將鳳眼蓮幼苗置于1 L的玻璃瓶中用培養(yǎng)基培養(yǎng)，不存在新發(fā)腋芽無法暴露于空氣中的問題。另外，二者施用激素的方式也不同，Pieterseetal.(1976)和本研究是將赤霉素噴灑在葉莖表面，而Watsonetal.(1982)是將赤霉素添加在培養(yǎng)基中經(jīng)由根系吸收，施用方式的不同可能造成吸收部位和效率的不同，進(jìn)而影響最終的功效。值得注意的是，Watson(1984)曾提出鳳眼蓮每個(gè)葉片的葉腋處都能產(chǎn)生新的腋芽進(jìn)而發(fā)育成克隆株，可見，腋芽生長(zhǎng)對(duì)鳳眼蓮克隆繁殖至關(guān)重要。而赤霉素對(duì)腋芽生長(zhǎng)的影響卻有完全相反的報(bào)道，如Nietal.(2016)發(fā)現(xiàn)赤霉素?zé)o論濃度高低都能促進(jìn)桐油樹腋芽的生長(zhǎng)，其機(jī)制牽涉與細(xì)胞分裂素協(xié)同調(diào)控腋芽的細(xì)胞分裂(Nietal.,2017)，而Zhangetal.(2019)卻報(bào)道赤霉素依賴DELLA-SPL9蛋白復(fù)合體抑制擬南芥腋芽的產(chǎn)生。由此可見，在植物體內(nèi)赤霉素通過不同的機(jī)制分別促進(jìn)或抑制腋芽的生長(zhǎng)，而這些機(jī)制之間如何相互作用并形成最終的生理功效卻不得而知。因此，今后應(yīng)繼續(xù)深入研究赤霉素對(duì)鳳眼蓮腋芽生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而明確其對(duì)鳳眼蓮克隆繁殖的作用。

鳳眼蓮是世界上已知生長(zhǎng)繁殖速度最快的植物之一，其快速生長(zhǎng)繁殖的調(diào)控因子和有針對(duì)性的防控策略仍有待更多的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)模擬自然條件下生長(zhǎng)的鳳眼蓮噴灑赤霉素可改變其植株形態(tài)，抑制葉片發(fā)育，最終造成生長(zhǎng)和無性克隆繁殖速度減緩，這為其未來的防控提供了一定參考。