陳晨,董朕，張東輝，李冰，程富勝，張繼瑜，周緒正

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

頭孢噻呋又名賽得福，是第一個(gè)專門用于動(dòng)物的頭孢菌素類抗生素，由Upjohn公司研制并被用于獸醫(yī)領(lǐng)域，產(chǎn)品是鈉鹽形式的Naxcel?無(wú)菌粉[1]。頭孢噻呋的抗菌譜廣，可通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成從而達(dá)到快速殺菌的作用[2-3]，廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[4]，但不規(guī)范使用會(huì)導(dǎo)致藥物殘留，引起細(xì)菌耐藥性增加，危害環(huán)境，而且通過(guò)食物鏈和環(huán)境直接或間接危害人類健康。歐盟制定頭孢噻呋在牛奶中的最大殘留限量(MRL)為100 μg/kg[5]；我國(guó)規(guī)定其在牛奶中的MRL為100 μg/kg，且規(guī)定其殘留標(biāo)識(shí)物為去呋喃甲?；^孢噻呋(DFC)[6]。

頭孢噻呋進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，絕大部分快速轉(zhuǎn)化為DFC等代謝物[7-9]，因?yàn)镈FC在動(dòng)物體內(nèi)不穩(wěn)定，動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)會(huì)干擾DFC的直接檢測(cè)，所以通常檢測(cè)時(shí)先將不穩(wěn)定的DFC轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙酰胺去甲基頭孢噻呋(DCA)，可通過(guò)采用二硫赤蘚糖醇將DFC與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，進(jìn)而通過(guò)碘乙酰胺處理生成穩(wěn)定的DCA[10]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號(hào)公告[11]頒布的用于動(dòng)物性食品中頭孢噻呋殘留檢測(cè)的高效液相色譜法操作復(fù)雜、重復(fù)性差、靈敏度低。因此，本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)的方法用于檢測(cè)牛奶中頭孢噻呋殘留，以期更好地了解該藥物在牛奶中的殘留消除規(guī)律并制定休藥期。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品：純度97.7%，購(gòu)自Dr.Ehrenstirfer GmbH；乙腈、甲醇和甲酸：質(zhì)譜純，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；二硫赤蘚醇：純度99%，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碘乙酰胺：純度98%，購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；十四水合硼酸鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸：購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜：色譜純，購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

選取甘肅省某奶牛場(chǎng)的20頭荷斯坦奶牛(高產(chǎn)、低產(chǎn)奶牛各10頭)。所有牛在近1月內(nèi)未使用頭孢噻呋類及與頭孢噻呋類結(jié)構(gòu)相似的藥物。體型大小、精神狀態(tài)、膘情等均需符合健康狀態(tài)，體重在250～450 kg。

1.3 給藥和樣品采集

注射用頭孢噻呋鈉，粉針劑，規(guī)格為1.0 g，生產(chǎn)批號(hào)：DVK181001，由河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司提供。按推薦劑量每千克體重2.2 mg肌肉注射給藥，連續(xù)3 d。于第1次給藥后4、12 h，第2次給藥后4、12 h，以及最后一次給藥后4、8、10、12和 24 h，采集4個(gè)乳區(qū)的混合奶樣，用于測(cè)定。

1.4 HPLC-MS/MS檢測(cè)牛奶中頭孢噻呋殘留

1.4.1 試劑的制備與保存

①取空白牛奶樣品作為空白試樣，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白添加試樣。②取儲(chǔ)備液(1 mg/mL)依次用超純水配置成50、100、200、400、600、1 000 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。③0.05 mol/L硼酸緩沖液：稱取19 g十四水合硼酸鈉和3.7 g氯化鉀溶于900 mL水中，調(diào)節(jié)pH=9，用水定容至1 L。④0.025 mol/L磷酸緩沖液：將3.5 g磷酸二氫鈉溶于900 mL水中，調(diào)節(jié)pH=7.0，用水定容至1 L。⑤0.4% DTE提取液：稱取1.0 g二硫赤蘚醇，溶于250 mL 0.05 mol/L硼酸緩沖液中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。⑥14%碘乙酰胺溶液：稱取7.0 g碘乙酰胺，溶于50 mL 0.025 mol/L磷酸緩沖液中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。⑦25%磷酸溶液：取25 mL磷酸，加水溶解并稀釋至100 mL。⑧-20 ℃以下保存樣品。

1.4.2 樣品前處理方法

提取和衍生：取牛奶(1±0.01) g，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦動(dòng)10 s，加0.4%二硫赤蘚糖醇溶液11 mL，渦動(dòng)2 min，55 ℃水浴振蕩15 min，取出放置室溫，加14%碘乙酰胺溶液3 mL，避光室溫下靜置衍生30 min，用25%的磷酸緩沖調(diào)節(jié)pH值至2.3左右，4 500 r/min、4 ℃離心20 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一支50 mL離心管中待用。

凈化：依次用10 mL甲醇、10 mL水活化C18萃取柱，取離心后的上清液過(guò)柱，用5 mL水淋洗之后，用6 mL 90%甲醇水溶液洗脫，洗脫液用氮吹儀吹干，用復(fù)溶液(0.1%甲酸水∶0.1%甲酸乙腈=80∶20)復(fù)溶殘余物，超聲10 min后，過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

1.4.3 色譜條件

流動(dòng)相：0.1%甲酸水，0.1%甲酸乙腈，流速：0.4 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。高效液相色譜的洗脫條件如表1所示。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

1.4.4 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源，掃描方式為正離子掃描，質(zhì)譜掃描模式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，離子源溫度：100 ℃，脫溶劑溫度：350 ℃，毛細(xì)管電壓：4 000 V，脫溶劑氣流速：11 L/min，定性離子對(duì)(m/z)：487>210，定量離子對(duì)(m/z)：487>241，錐孔電壓：110 V，碰撞能量：15 eV。

1.4.5 特異性

分析空白奶樣(n=20)，觀察在藥峰出現(xiàn)的區(qū)域是否有干擾。

1.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別設(shè)置7個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次為50、100、200、400、600和1 000 μg/kg，依據(jù)設(shè)定濃度加入標(biāo)準(zhǔn)品，添加頭孢噻呋于空白牛奶樣品中，按照前述方法進(jìn)行提取、凈化、復(fù)溶，HPLC-MS/MS檢測(cè)，以所得峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程與相關(guān)系數(shù)。

1.4.7 方法的檢出限(LOD)與定量限(LOQ)

采用最常見(jiàn)的檢出限與定量限的確定方法，即信噪比(S/N)法：分別以3倍信噪比和10倍信噪比作為檢出限和定量限。

1.4.8 方法的準(zhǔn)確度與精密度

用添加回收試驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，用回收率表示準(zhǔn)確度。按照前述“1.4.2”方法處理樣品，選擇LOQ(50 μg/kg)、MRL(100 μg/kg)、2MRL(200 μg/kg)進(jìn)行添加回收，每個(gè)濃度5個(gè)重復(fù)，進(jìn)行3次單獨(dú)試驗(yàn)。

按照前述“1.4.2”方法處理樣品，選擇LOQ(50 μg/kg)，2LOQ(100 μg/kg)，10LOQ(500 μg/kg)，每個(gè)濃度5個(gè)樣品，重復(fù)測(cè)定3次，分別計(jì)算回收率和批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以及批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.9 方法的穩(wěn)定性

方法的穩(wěn)定性包括反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性，8 h室溫放置穩(wěn)定性以及長(zhǎng)期凍融穩(wěn)定性。按照前述“1.4.2”方法處理樣品，選擇LOQ(50 μg/kg)、2MRL(200 μg/kg)進(jìn)行添加回收，在樣品反復(fù)凍融3次前后、在前處理時(shí)(記為0 h)和處理后8 h以及長(zhǎng)期凍融后檢測(cè)，分析藥物在牛奶中的穩(wěn)定性。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每頭牛每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取3個(gè)平行奶樣檢測(cè)，取其平均值作為最終檢測(cè)結(jié)果，應(yīng)用WTM1.4軟件計(jì)算頭孢噻呋在牛奶中的棄奶期(WT)。

2 結(jié)果

2.1 特異性

分析不同來(lái)源的空白牛奶樣品，目標(biāo)化合物的保留時(shí)間附近沒(méi)有雜質(zhì)干擾，牛奶空白基質(zhì)色譜如圖1所示。

圖1 牛奶空白基質(zhì)特征離子質(zhì)量色譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限以及定量限

在50～1 000 μg/kg的濃度范圍內(nèi)，方法的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)>0.99，頭孢噻呋的方法檢出限為25 μg/kg，其色譜如圖2所示，定量限50 μg/kg，其色譜如圖3所示。

圖2 頭孢噻呋衍生物DCA的檢測(cè)限色譜

圖3 頭孢噻呋衍生物DCA的定量限色譜

2.3 準(zhǔn)確度

選擇50、100和200 μg/kg進(jìn)行添加回收，每個(gè)濃度計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示，3個(gè)添加濃度的回收率為96.48%～100.19%，滿足《獸藥殘留試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[12]。

表2 加樣回收率結(jié)果 %

2.4 精密度

由表3可知，選擇50、100和500 μg/kg為添加濃度進(jìn)行方法精密度考察，批內(nèi)精密度為2.09%～11.22%，批間精密度2.36%～12.31%(RSD，變異系數(shù))。結(jié)果滿足《獸藥殘留試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[12]。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性

2.5.1 待測(cè)藥物在凍融過(guò)程中的穩(wěn)定性

由表4可知，添加50和200 μg/kg的頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品在牛奶樣品凍融過(guò)程中，待測(cè)物的變異系數(shù)為10.39%和12.67%。

表4 待測(cè)藥物在凍融過(guò)程中的穩(wěn)定性

2.5.2 待測(cè)藥物室溫放置8 h穩(wěn)定性

由表5可知，添加50 和200 μg/kg頭孢噻呋標(biāo)品進(jìn)行前處理后，室溫放置8 h穩(wěn)定性檢測(cè)，待測(cè)物的變異系數(shù)為10.08%和8.48%。

表5 待測(cè)藥物室溫放置8 h的穩(wěn)定性

2.5.3 待測(cè)藥物在牛奶中的長(zhǎng)期穩(wěn)定性

由表6可知，分別添加50 和200 μg/kg的頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品于牛奶中混勻，分別在冷凍當(dāng)日(記為0)和冷凍1月進(jìn)行前檢測(cè)，分析待測(cè)藥物在牛奶中的穩(wěn)定性，變異系數(shù)分別為7.47%和8.08%。

表6 待測(cè)藥物在牛奶中的長(zhǎng)期穩(wěn)定性

2.6 牛奶中頭孢噻呋鈉的濃度

按照本研究建立的方法，對(duì)采集的牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)。在第1次給藥后4和12 h，牛奶中去呋喃甲?；^孢噻呋的殘留量均低于規(guī)定的MRL(100 μg/kg)，且大多數(shù)采樣點(diǎn)的殘留量低于定量限(LOQ=50 μg/kg)。連續(xù)3 d給藥后，對(duì)所有奶牛在給藥后4、8、10、12和24 h采集奶樣進(jìn)行殘留分析，其中18頭奶牛的奶中去呋喃甲?；^孢噻呋的大多數(shù)都低于定量限，也小于規(guī)定的MRL，這表明頭孢噻呋鈉在奶牛體內(nèi)代謝快。其中3087號(hào)奶牛在第3次給藥后10 h以及3513號(hào)奶牛在第3次給藥后4 h去呋喃甲?；^孢噻呋的濃度分別為113.79和166.10 μg/kg，高于MRL，其余奶牛在所有采樣點(diǎn)的濃度均低于MRL。這表明奶牛體內(nèi)殘留消除存在差異性，可能和個(gè)體體態(tài)等因素有關(guān)。

2.7 牛奶中頭孢噻呋鈉的休藥期

頭孢噻呋鈉的MRL為100 μg/kg，通過(guò)WTM1.4軟件計(jì)算注射用頭孢噻呋鈉的棄奶期為7.148 h，棄奶期結(jié)果如圖4所示。

圖4 頭孢噻呋鈉在牛奶中的殘留消除規(guī)律

3 討論

頭孢噻呋屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，主要用于治療禽畜的細(xì)菌性呼吸道感染等疾病，臨床效果好，優(yōu)于傳統(tǒng)的磺胺、氯霉素、慶大霉素及恩諾沙星、泰樂(lè)菌素、氟苯尼考等，無(wú)任何明顯的毒副作用，耐藥率相對(duì)較低[13-14]，應(yīng)用范圍廣。因此，對(duì)該藥物在食品動(dòng)物中的殘留檢測(cè)就顯得尤為重要。

HPLC-MS/MS方法因其具有良好的適用性和高靈敏度，常在抗生素殘留檢測(cè)中發(fā)揮重要的作用[15-16]。本研究建立了頭孢噻呋在原料奶中的藥物殘留HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，經(jīng)過(guò)梯度洗脫，優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件，優(yōu)化了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中固相萃取柱的選擇，樣品只需經(jīng)過(guò)C18萃取柱1次，簡(jiǎn)化了之前方法中繁瑣的過(guò)柱程序，操作簡(jiǎn)單。其色譜峰的保留時(shí)間在3 min左右，峰形尖銳，兩邊對(duì)稱，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)考察，方法靈敏度好，回收率高，檢測(cè)限可達(dá)25 μg/kg，滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)于該藥的檢測(cè)要求[17]。

對(duì)于所有肌肉注射給藥的奶牛，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的采樣點(diǎn)進(jìn)行殘留分析，除1頭奶牛在第3次給藥后10 h以及1頭奶牛在第3次給藥后4 h去呋喃甲?；^孢噻呋的濃度分別為113.79和166.10 μg/kg，其余奶牛在所有采樣點(diǎn)的濃度均低于最大殘留限量。 由以上數(shù)據(jù)可看出，奶牛按照推薦劑量給藥后，牛奶中殘留標(biāo)識(shí)物去呋喃甲酰基頭孢噻呋消除較快。據(jù)報(bào)道，給奶牛肌肉注射2.2 mg/kg的14C-頭孢噻呋，在最后一個(gè)劑量后10 h牛奶中殘留量最多，殘留量為71 μg/kg，到12 h降到40 μg/kg[5]。本研究中相同時(shí)間點(diǎn)殘留量略有不同，但在最后一次給藥后12 h殘留量都低于定量限，也低于最大殘留限量，這可能與奶牛的個(gè)體差異有關(guān)，但是總體殘留消除趨勢(shì)與國(guó)外其他報(bào)道基本相符[5,18]。除去異常值，包括殘留最高點(diǎn)在內(nèi)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)殘留量均低于我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的最大殘留限量。

國(guó)外對(duì)于頭孢噻呋的研究已經(jīng)證明，頭孢噻呋殘留量低，高效安全，F(xiàn)DA已經(jīng)確定其無(wú)牛奶棄奶期[19]。但是我國(guó)缺乏該藥在牛上的殘留數(shù)據(jù)，也沒(méi)有相關(guān)棄奶期的規(guī)定。基于此，我們進(jìn)行了注射用頭孢噻呋鈉在牛奶中的殘留消除試驗(yàn)，以期了解該藥物在牛奶中的殘留消除規(guī)律并制定休藥期。通過(guò)WTM1.4軟件計(jì)算注射用頭孢噻呋鈉在牛奶中的棄奶期為7.148 h。為了確保動(dòng)物食品安全，防止個(gè)體差異，以及考慮到臨床實(shí)際操作等，參考標(biāo)準(zhǔn)以及本次試驗(yàn)的結(jié)果，建議將注射用頭孢噻呋鈉的棄奶期定為12 h。

綜上，本研究建立的注射用頭孢噻呋鈉的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，特異性強(qiáng)、回收率高、重復(fù)性好，檢測(cè)限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg，滿足頭孢噻呋鈉在牛奶中的殘留檢測(cè)要求。根據(jù)其殘留消除規(guī)律建議頭孢噻呋鈉在牛奶中的棄奶期為12 h。