石柯，劉巧玲，張森，林泠，任杰，湯德元，曾智勇，王彬，明東東，李思南，黃濤

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

牛病毒性腹瀉(BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的急性、熱性傳染病，可引起免疫抑制，以發(fā)熱、腹瀉、懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出死胎、畸形胎為主要癥狀。懷孕母牛可將病毒垂直傳播給新生小牛，引起持續(xù)感染，牛終生帶毒，這也是該病很難徹底根除的最主要原因[1]。牛冠狀病毒(bovine coronavirus，BCoV)是狀病毒科乙型冠狀病毒屬成員，為線狀單股正鏈RNA病毒，是導(dǎo)致犢牛腹瀉的重要病原[2]，該病毒也可引起成年牛的冬痢和呼吸道疾病，且易發(fā)生混合感染[3]。BCoV所引起的犢牛呼吸道疾病通常表現(xiàn)為亞臨床型，多見于12～16周齡犢牛，可出現(xiàn)輕度呼吸道癥狀，如鼻炎、咳嗽和噴嚏，也可侵害下呼吸道[4]。該病毒是在腸道上皮及上呼吸道上皮內(nèi)復(fù)制的一種環(huán)境性病原，飼養(yǎng)管理不當(dāng)、嚴(yán)寒濕潤、應(yīng)激等因素可促使BCoV感染，常呈地方流行性，發(fā)病過的牛場幾年內(nèi)可連續(xù)感染，臨床上難以凈化[5]。牛皰疹病毒1型(bovine herpesvirus type 1，BHV-1)是導(dǎo)致牛傳染性鼻氣管炎(IBR)主要病因，臨床上以急性、高熱、呼吸困難、流鼻液、上呼吸道及其氣管黏膜發(fā)炎為主要癥狀[6]。我國于1980年首次從新西蘭引進(jìn)的牛群中分離到BHV-1[7]。目前該病在我國牛群中的流行呈上升趨勢，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。牛支原體(Mycoplasmabovis，MB)是牛的一種重要的致病性支原體，其主要引起牛的肺炎和乳腺炎，也可引起關(guān)節(jié)炎和流產(chǎn)[9-10]。本次試驗通過對貴州省7個地區(qū)牛場所采集的樣品進(jìn)行PCR檢測，并對陽性樣品進(jìn)行測序與分析，旨在了解貴州省牛BVDV、BHV-1、BCoV、MB的感染情況。在BVDV基因組中5′-UTR是最保守的基因序列[11]，E2基因是BVDV的囊膜糖蛋白，是中和抗體的主要靶點[12]，因此5′-UTR和E2基因常用于BVDV的分子特征分析靶標(biāo)[13]。通過對BVDV分子特征分析，了解貴州省流行的BVDV亞型，為貴州省牛BVD進(jìn)一步防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2018年2月—2020年4月間采集貴州不同地區(qū)牛場的牛鼻拭子共224份，其中：貞豐縣35份、大方縣33份、銅仁市28份、關(guān)嶺縣45份、都勻縣27份、開陽縣18份和凱里市38份。所有樣品均為隨機采樣。

1.2 主要試劑

分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000 DNA Marker、M-MLV酶、dNTP、Oligo Primer、RNA酶抑制劑、TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、pMD19-T Vector、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購自大連寶生物工程有限公司；金牌Mix(green)購自武漢擎科創(chuàng)新生物公司；EZNATM Gel Extraction Kit(50)膠回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.3 樣品檢測

處理過的樣品采用DNA/RNA提取試劑盒對采集的224份樣品進(jìn)行核酸提取。將提取的核酸產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將提取的病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照Magen公司M-MLV H-First Stand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR檢測

參照NCBI中發(fā)表的BVDV 5′-UTR(MK059454)、BCoVgN(NC003045)、MBuvrC(AF003959)、BHV1gB(AJ004801)等基因的序列，運用Primer 5.0設(shè)計引物，用于擴(kuò)增目的基因片段，BVDV E2基因選擇借鑒王夢心等[14]的引物設(shè)計方法，引物序列詳見表1。引物由武漢擎科創(chuàng)新生物公司合成。

表1 擴(kuò)增目的片段的引物

PCR反應(yīng)體系為25 μL，金牌Mix(green)21 μL，上、下游引物各1 μL，DNA或cDNA模板各2 μL，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；退火溫度54 ℃ 45 s；72 ℃ 30 s，共進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；所有檢測樣品均設(shè)陽性和陰性對照。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

將BVDV的5′-UTR和E2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去武漢擎科創(chuàng)新生物公司克隆測序。從GenBank中獲取 BVDV基因1、2型部分代表株15株(詳見表2)，作為序列參考，利用生物分析軟件MEGA7.0及DNAman進(jìn)行對比分析，構(gòu)建進(jìn)化樹。

表2 參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測

采用PCR方法對各個縣市的樣品進(jìn)行檢測，部分樣品檢出特異性條帶，說明存在病毒感染，結(jié)果如圖1～4。

由表2可見，各個縣市BVDV陽性率在11.11%～18.19%，平均陽性率15.67%；BHV-1陽性率在0～15.15%，平均陽性率7.37%；BCoV陽性率在0～14.28%，平均陽性率7.46%；MB陽性率5.56%～17.14%，平均陽性率12.50%。其中BVDV和MB的混合感染率為0～6.06%；BVDV和BHV-1的混合感染率為0～3.03%，MB和BHV-1的混合感染率為0～3.57%，MB和BCoV的混合感染率為0～3.70%。未發(fā)現(xiàn)3種及其以上的病毒同時感染的病例。

M. DL2000 DNA Marker；1. 陽性對照；2～6. 部分樣品；7. 陰性對照

M.DL2000 DNA Marker；1. 陽性對照；2～6. 部分樣品；7. 陰性對照

M.DL2000 DNA Marker；1. 陽性對照；2～6. 部分樣品；7. 陰性對照

M.DL2000 DNA Marker；1. 陽性對照；2～6. 部分樣品；7. 陰性對照

表2 貴州省部分地區(qū)牛BVDV、MB、BHV-1、BCoV病原學(xué)調(diào)查結(jié)果分析 %

2.2 BVDV 5′-UTR基因與E2基因序列進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明(如圖5、圖6所示)，4份BVDV陽性樣品均為BVDV-1型，其中有3份為BVDV-1m亞型，1份為BVDV-1b1亞型。樣品GUIZOU-1、GUIZOU-2、GUIZOU-3與BVDV-1m型毒株ZM-95遺傳關(guān)系相近，屬于同一分支，有較近的親緣關(guān)系；GUIZOU-4與BVDV-1B1型毒株VEDEVAC遺傳關(guān)系接近。

注：▲GUIZOU-1、GUIZOU -2、GUIZOU -3、GUIZOU -4均為本次試驗陽性樣品。下同

圖6 BVDV E2基因遺傳進(jìn)化樹

3 討論

BVDV、BCoV、BHV1和MB是引起牛呼吸道綜合征的主要病因，并且以多重感染或混合感染為主要感染形式[8, 14-15]。BVDV 5′-UTR的核苷酸序列呈現(xiàn)高度保守性，因此常作為核苷酸序列設(shè)計特異性引物，對BVDV進(jìn)行檢測和分離鑒定[16]。童欽等[17]調(diào)查了內(nèi)蒙古部分地區(qū)的509份牛血清樣品，BVDV抗體陽性率為58.35%。姚偉等[18]對遼寧省的739份血清樣品進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，BVDV抗體陽性率為74%。劉澤余等[19]對吉林省的325份血清樣品進(jìn)行了抗體和抗原的檢測，BVDV抗體陽性率為77%，抗原陽性率為12.92%。姚志蘭等[20]對2016—2017年在江浙部分地區(qū)采集了145份臨床腹瀉犢奶牛血清樣品進(jìn)行檢測，BVDV陽性率為13.1%。而西部病原調(diào)查的數(shù)據(jù)不全。本次研究只對貴州部分縣市進(jìn)行BVDV病原檢測，平均陽性率為15.67%。高于吉林省并且與江浙部分地區(qū)相近，說明貴州地區(qū)有較多的BVDV感染牛。何美琳等[21]對四川省阿貝州8個縣市1 070份牛血清樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)BCoV的抗體陽性率為84.11%。權(quán)英存等[22]通過RT-PCR方法，檢測了青海省部分地區(qū)具有明顯腹瀉癥狀牛的腸道、糞便等樣品32份，發(fā)現(xiàn)BCoV陽性率為34.38%。2015—2017年，He等[23]采集西藏、青海藏區(qū)、四川藏區(qū)和云南藏區(qū)3月齡以內(nèi)牦牛腹瀉糞便樣本共 336 份，平均陽性率為69.05%，其中西藏為68.33%，青海為71.67%，四川為69.23%，云南為66.67%。本次研究中發(fā)現(xiàn)貴州部分縣市BCoV的平均陽性率7.46%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他地區(qū)，分析可能原因是本次研究中的樣品均采用的牛鼻拭子而其他研究多采用牛腹瀉糞便樣本。王淑娟等[24]對北京、天津、陜西、山東、山西、河南、河北等地的奶牛場進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示BHV-1的個體陽性率在0～55.00%，群體陽性率為77.8%。本次研究中BHV-1平均陽性率僅為7.37%，處于一個比較低的水平，可能是由于選取的牛多為成年牛并且多為自家養(yǎng)殖，并沒有大規(guī)模與周邊地區(qū)頻繁交易，所以平均陽性率普遍低于其他省市。根據(jù)張信軍[25]對76份臨床樣品檢測，BVDV與BHV-1混合感染率為6.58%，并且該研究并未發(fā)現(xiàn)3種病毒的混合感染。本次研究中BVDV和MB的混合感染率0～6.06%；BVDV和BHV-1的混合感染率0～3.03%，MB和BHV-1的混合感染率0～3.57%，MB和BCoV的混合感染率0～3.70%，并且沒有發(fā)現(xiàn)3種及其以上的感染病例。

由于中國地域遼闊，物種繁多，疾病的流行及病毒的遺傳演化情況十分復(fù)雜。研究表明，已從中國牛群中分離到BVDV-1和BVDV-2型病毒。中國主要流行的亞型為BVDV-1b和BVDV-1m型，其中青藏高原的主要流行亞型是BVDV-1q和BVDV-1b型，新疆地區(qū)分離到的病毒主要為BVDV-1q和BVDV-1f亞型[26]。為了進(jìn)一步了解貴州地區(qū)牛場BVDV流行株的亞型，本次研究還對其中的4份陽性樣品進(jìn)行測序，使用MEGA7生物學(xué)軟件和GenBank下載的15株毒株進(jìn)行遺傳演化分析，結(jié)果顯示，本次研究的3份陽性樣品GUIZOU-1、GUIZOU-2、GUIZOU-3與參考株ZM-95親緣性比較近，并且處于同一分支，同屬于BVDV-1m型；GUIZOU-4與VEDEVAC親緣關(guān)系比較接近，為BVDV-1b。本次樣品的采集主要集中于貴州地區(qū)，但是VEDEAVC是匈牙利的毒株。蔡元慶等[27]在新疆也發(fā)現(xiàn)同源性接近匈牙利毒株的毒株，所以推測可能是新疆地區(qū)牛群傳播到貴州省或從歐洲引種傳播到貴州省。本研究發(fā)現(xiàn)的2種BVDV亞型與我國主要流行的亞型基本吻合，為分析貴州地區(qū)BDVD的流行提供了參考意義。

本次研究首先從病原學(xué)方面對貴州省部分地區(qū)的牛場進(jìn)行了BVDV、BHV-1、BCoV、MB感染的流行病學(xué)調(diào)查，并且針對BVDV的基因型、基因亞型的感染情況進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，證實了貴州地區(qū)牛場存在多種疾病和BVDV多種基因型的感染，為貴州省進(jìn)行牛呼吸道疾病的防控提供了可靠的依據(jù)。