不同商品規(guī)格吳茱萸有效成分含量和肝細(xì)胞毒性的研究

張 薇，任 昆，王冬梅，吳雙鳳，曲壽河，程喜樂，任舒蒙，潘英妮*，劉曉秋*

不同商品規(guī)格吳茱萸有效成分含量和肝細(xì)胞毒性的研究

張 薇1，任 昆1，王冬梅2，吳雙鳳1，曲壽河1，程喜樂1，任舒蒙1，潘英妮1*，劉曉秋1*

1. 沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016 2. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016

評(píng)價(jià)市售吳茱萸的質(zhì)量并研究不同商品規(guī)格吳茱萸中化學(xué)成分與肝細(xì)胞毒性的相關(guān)性，為吳茱萸全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。按吳茱萸藥材商品規(guī)格收集小花吳茱萸7批，中花吳茱萸22批，大花吳茱萸10批，建立了UPLC法同時(shí)測(cè)定吳茱萸中檸檬苦素（limonin，LIM）、吳茱萸堿（evodiamine，EVD）、吳茱萸次堿（rutaecarpine，RUT）、1-甲基-2-壬基-4-(1)-喹諾酮[1-methyl-2-nonyl-4(1)-quinolone，MNQ]、1-甲基-2-十一烷基-4(1)-喹諾酮[1-methyl-2-undecyl-4(1)-quinolone，MUQ]和吳茱萸新堿（evocarpine，EVC）的含量；采用CCK-8法檢測(cè)吳茱萸對(duì)L02肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。運(yùn)用SIMCA-P 14.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)吳茱萸的細(xì)胞存活率進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。有19批商品符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，不符合藥典要求的20批樣品中有10批為藥材基原不符，有1批EVD和RUT的總量不符合藥典規(guī)定，9批LIM含量不符合藥典規(guī)定。7批小花吳茱萸中1批不符合藥典要求，22批中花吳茱萸中10批不符合藥典要求，10批大花吳茱萸中9批不符合藥典要求。同時(shí)發(fā)現(xiàn)小花吳茱萸中LIM含量高于中花和大花吳茱萸，而生物堿含量中花和大花吳茱萸中較高。其中S33～S39樣品按果實(shí)大小屬于中花吳茱萸但不含LIM，將其稱為中花樣吳茱萸劣品?；诮⒌腢PLC方法同時(shí)測(cè)定吳茱萸中LIM和5種生物堿含量；PCA分析模型將小花吳茱萸、中花吳茱萸、大花吳茱萸和中花樣吳茱萸劣品的毒性很好地區(qū)分為4個(gè)區(qū)域，對(duì)L02肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用為中花樣吳茱萸劣品＞大花吳茱萸＞中花吳茱萸＞小花吳茱萸，且LIM與5種生物堿的比值和吳茱萸對(duì)L02肝細(xì)胞的半數(shù)抑制率（IC50）總體上呈正相關(guān)。吳茱萸的毒性與LIM和5種生物堿比例有關(guān)，LIM與5種生物堿含量和的比值越大，吳茱萸樣品毒性越小。提示大花吳茱萸不適合作為商品流通，同時(shí)吳茱萸質(zhì)量控制應(yīng)考慮藥材中LIM和生物堿類成分含量的比例。

吳茱萸；商品規(guī)格；UPLC；檸檬苦素；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；生物堿；肝細(xì)胞毒性

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸(Juss.) Benth.、石虎(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang或疏毛吳茱萸(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang的干燥近成熟果實(shí)，收載于《中國(guó)藥典》2020年版，有小毒。具有治療嘔吐、腹瀉、頭痛、胃痛、痛經(jīng)等功效。商品流通中按果實(shí)的粒頭大小吳茱萸被分成小花吳茱萸、中花吳茱萸和大花吳茱萸[1]。市場(chǎng)上果實(shí)的粒頭大小不同，開裂程度不同，售賣價(jià)格也不同?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究對(duì)吳茱萸的肝毒性報(bào)道不一致，Kim等[2]研究表明2 g/kg吳茱萸水提物連續(xù)給藥13周，每周給藥5次，大鼠沒有明顯不良反應(yīng)。楊秀偉等[3]研究表明10 g/kg吳茱萸水提取和70%乙醇提取物，每天1次，連續(xù)給藥7 d對(duì)昆明小鼠沒有產(chǎn)生急性毒性。黃偉等[4]研究表明昆明小鼠單次ig 2.1、4.1、8.2、16.3和32.5 g/kg吳茱萸水提物，小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和堿性磷酸酶（aspartate aminotransferase，AST）含量顯著增加，具有劑量依賴關(guān)系。張晟瑞等[5]研究表明以0.65、3.25、6.50 g/kg連續(xù)給藥5、10、15 d后，小鼠血清中ALT、AST、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）的含量顯著升高。李莉等[6]收集吳茱萸、石虎和疏毛吳茱萸3個(gè)品種吳茱萸樣品，研究表明16.67 g/kg吳茱萸水提物連續(xù)15 d ig給予昆明小鼠，表明小鼠血清中ALT和AST含量顯著增加，肝毒性大小與品種沒有明顯相關(guān)性，而與產(chǎn)地密切相關(guān)。Li等[7]研究了16個(gè)產(chǎn)地共19批35 g/kg吳茱萸50%乙醇提取物對(duì)小鼠的肝毒性，表明山東和陜西的吳茱萸對(duì)小鼠沒有產(chǎn)生肝毒性，江西的吳茱萸肝毒性最強(qiáng)，江蘇、廣東、湖南和廣西的吳茱萸毒性較弱。隨著吳茱萸的廣泛應(yīng)用，吳茱萸的肝毒性引起了廣泛關(guān)注，但不同商品規(guī)格吳茱萸的化學(xué)成分和毒性差異未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從不同商品規(guī)格的角度探究吳茱萸的成分與肝毒性的關(guān)系，為吳茱萸的質(zhì)量控制和安全用藥提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters UPLC ACQUITY型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；DZKW型電子恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）；KQ5200型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Varioskan Flash型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；CLM-170B-8-NF型恒溫CO2培養(yǎng)箱（新加坡藝思高科技有限公司）；BDS400倒置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）

1.2 試藥

對(duì)照檸檬苦素（LIM）、吳茱萸堿（EVD）和吳茱萸次堿（RUT）均購(gòu)于成都普菲徳生物技術(shù)有限公司；1-甲基-2-壬基-4(1)-喹諾酮（MNQ）、1-甲基-2-十一烷基-4(1)-喹諾酮（MUQ）和吳茱萸新堿（EVC）均購(gòu)于上海紫霞生物技術(shù)有限公司，所有對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）、乙醇和甲酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）、娃哈哈礦泉水（杭州娃哈哈集團(tuán)）；RPMI 1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素、PBS和細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8）均購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司。

39批吳茱萸來源于安徽、貴州、廣西、湖北、四川、浙江、江西、云南和湖南9個(gè)產(chǎn)地，根據(jù)藥材的大小分為小花吳茱萸（果實(shí)直徑2～3 mm）、中花吳茱萸（果實(shí)直徑5 mm左右）和大花吳茱萸（果實(shí)直徑6～10 mm，其多開裂）3個(gè)商品規(guī)格（圖1和表1），經(jīng)沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院潘英妮副教授鑒定為吳茱萸(Juss.) Benth.和疏毛吳茱萸(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang的干燥近成熟果實(shí)以及巴氏吳茱萸Rehd. et Wils.、少果吳茱萸(Juss.) Benth. f.(Hand. -Mazz.) Huang、臭辣子Dode、華南吳茱萸Hand. -Mazz.和野茶辣sp.的干燥果實(shí)，具體見表1。

圖1 不同商品規(guī)格的吳茱萸

表1 市售吳茱萸樣品信息

“+”為根據(jù)課題組前期對(duì)LIM、EVD、RUT的測(cè)定結(jié)果符合《中國(guó)藥典》2020年版的樣品，“?”未檢測(cè)到LIM或LIM、EVD、RUT的測(cè)定結(jié)果不符合《中國(guó)藥典》2020年版的樣品

“+” means the research group found the samples that met the 2020 edition of Chinese Pharmacopoeia according to the determination results of LIM, EVD and RUT, “?” means LIM was not detected or determination results of LIM, EVD and RUT don't meet the 2020 edition of Chinese Pharmacopoeia

2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸中6個(gè)指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 取吳茱萸粉末約0.3 g，精密稱定，加70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲提取40 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量后補(bǔ)足失重，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取LIM、EVD、RUT、MNQ、MUQ和EVC對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得LIM、EVD、RUT、MNQ、MUQ和EVC質(zhì)量濃度分別為204.5、520、511、507、502、495 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫：0～8 min，95%～5% B；8～10 min，5% B；10～12 min，5%～95% B。體積流量為0.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.1.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密稱取吳茱萸適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，另取對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。將供試品溶液色譜圖和對(duì)照品溶液色譜圖比較，結(jié)果表明，供試品溶液中的其它成分不干擾LIM、EVD、RUT、MNQ、MUQ和EVC的測(cè)定。各峰與相鄰峰分離度大于1.5。LIM、EVD、RUT、MNQ、MUQ和EVC的保留時(shí)間分別是5.20、6.52、6.86、7.56、8.25、8.42 min，見圖2。

1-LIM 2-EVD 3-RUT 4-MNQ 5-MUQ 6-EVC

2.1.5 線性方程的繪制 分別精密量取“2.1.2”項(xiàng)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋配制成LIM質(zhì)量濃度為5.1、7.7、10.2、15.3、20.5和40.9 μg/mL；EVD質(zhì)量濃度為2.0、5.2、6.5、13.0、26.0和58.5 μg/mL；RUT質(zhì)量濃度為1.0、1.7、3.8、7.7、19.2和38.3 μg/mL；MNQ質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.8、1.5、2.5和4.1 μg/mL；MUQ質(zhì)量濃度為0.3、0.8、0.9、1.5、3.8和8.0 μg/mL和EVC質(zhì)量濃度為0.8、2.0、4.1、9.3、18.6和37.1 μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣2 μL。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，所得回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 吳茱萸中6種成分的回歸方程

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算色譜峰面積RSD，結(jié)果LIM、EVD、RUT、MNQ、MUQ和EVC色譜峰面積RSD分別為和0.4%、0.3%、0.3%、0.3%、0.4%和0.3%。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（S9），按照“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液6份，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算LIM、EVD、RUT、MNQ、MUQ和EVC含量，RSD分別為2.7%、2.5%、2.4%、2.8%、1.7%和2.2%。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（S9），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，LIM、EVD、RUT、MNQ、MUQ和EVC峰面積的RSD分別為0.4%、0.4%、0.2%、0.9%、0.2%和0.4%。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定的樣品（S9），精密稱定，每份0.15 g，分別加入一定量的對(duì)照品，按“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，進(jìn)行回收率測(cè)定，LIM、EVD、RUT、MNQ、MUQ和EVC加樣回收率分別為100.06%、101.45%、98.06%、99.75%、98.59%和100.91%，RSD分別為2.5%、2.7%、2.3%、2.3%、1.9%和1.8%。

2.1.10 樣品測(cè)定 精密稱取吳茱萸適量，照“2.2.1”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，按“2.1.3”條下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各樣品6種成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 市售吳茱萸中6種成分的含量及其對(duì)L02細(xì)胞毒性

“?”代表未檢測(cè)到

“?” means not detected

2.2 CCK-8法測(cè)定吳茱萸對(duì)L02肝細(xì)胞的毒性

2.2.1 吳茱萸提取物的制備 取吳茱萸粉末各約50 g，加8倍量50%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮，即得。

2.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng) 取L02肝細(xì)胞用10 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%，PBS清洗1次。棄去上清液，加入4 mL的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，待消化完全后加入完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。吹打細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)各處細(xì)胞，收集混合液至10 mL離心管，于1000 r/min離心7 min。棄去上清液，按1∶2進(jìn)行傳代，將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02肝細(xì)胞，按細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/孔鋪至96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入含7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL吳茱萸的完全培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置DMSO對(duì)照組，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h吸去培養(yǎng)基。每孔加入100 μL含10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光度（）值，計(jì)算IC50。利用excel 的FORECAST命令，通過線形回歸方程返回一個(gè)預(yù)測(cè)值計(jì)算IC50值，結(jié)果見表3，39批樣品對(duì)L02肝細(xì)胞增殖均有抑制作用。小花吳茱萸的IC50值為105.06～486.99 μg/mL；中花吳茱萸的IC50值為44.91～94.80 μg/mL；大花吳茱萸的IC50值為42.96～80.01 μg/mL；中花樣吳茱萸劣品的IC50值為20.41～54.21 μg/mL。中花吳茱萸與大花吳茱萸IC50有交叉，如中花吳茱萸（S13）的IC50值較小，可以看出毒性與LIM與生物堿之和的比值（0.006）密切相關(guān)。不同商品規(guī)格吳茱萸對(duì)L02肝細(xì)胞均有一定程度的抑制作用，對(duì)L02肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用總體呈現(xiàn)中花樣吳茱萸劣品＞大花吳茱萸＞中花吳茱萸＞小花吳茱萸，采用SPSS（25.0）計(jì)算顯著性，見圖3，不含LIM的中花樣吳茱萸劣品毒性最大；含結(jié)果有LIM的樣品中，小花吳茱萸毒性最弱，中花吳茱萸毒性介于二者之間，大花吳茱萸毒性最大。

2.2.4 主成分分析（PCA） 運(yùn)用SIMCA-P 14.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)39批吳茱萸樣品的細(xì)胞存活率進(jìn)行PCA。PCA模型將小花吳茱萸、中花吳茱萸、大花吳茱萸和中花樣吳茱萸劣品的毒性很好地區(qū)分為4組（圖4），不同商品規(guī)格的吳茱萸的毒性差異明顯。

a、b、c、d表示各組之間有顯著性（P＜0.01） 1-小花吳茱萸 2-中花吳茱萸 3-大花吳茱萸 4-中花樣吳茱萸劣品

2.2.5 基于熱圖分析吳茱萸化學(xué)成分與其對(duì)L02細(xì)胞IC50相關(guān)性 將商品吳茱萸中LIM和5種生物堿的含量與其對(duì)L02細(xì)胞的IC50值進(jìn)行熱圖分析（圖5），從上至下，當(dāng)LIM的含量越高時(shí)，5種生物堿含量越低，LIM與5種生物堿含量和的比值越大，IC50值越大，細(xì)胞毒性越小?？偟膩碚f，吳茱萸樣品的IC50值與LIM與5種生物堿和的含量的比值呈正相關(guān)。

綠色為小花吳茱萸，黃色為中花吳茱萸，紅色為大花吳茱萸，藍(lán)色為中花樣吳茱萸劣品

圖5 市售吳茱萸中LIM和5種生物堿的含量與其對(duì)L02細(xì)胞IC50值的熱圖

3 討論

3.1 市售吳茱萸商品的質(zhì)量情況

近年常發(fā)現(xiàn)與吳茱萸名稱相似或外觀性狀相近的混偽品出現(xiàn)[8-9]，如蕓香科植物巴氏吳茱萸、少果吳茱萸、臭辣子、華南吳茱萸和野茶辣的干燥近成熟果實(shí)或成熟果實(shí)冒充吳茱萸使用的情況。課題組從2015年開始采集和收集吳茱萸樣品，共39批。其中小花吳茱萸（S1～S7）均為藥典收載品種；中花吳茱萸（S8～S22）中12批為藥典規(guī)定品種，1批為臭辣子的干燥近成熟的果實(shí)，2批為野茶辣的干燥果實(shí)；大花吳茱萸（S23～S32）中3批為藥典品種的干燥成熟果實(shí)，其余7批分別為巴氏吳茱萸、臭辣子、華南吳茱萸、野茶辣和少果吳茱萸的干燥成熟果實(shí)；中花樣吳茱萸劣品（S33～S39）均為吳茱萸干燥近成熟果實(shí)。

指標(biāo)成分含量方面，有10批樣品不符合藥典規(guī)定（見支持信息表1），樣品S3中EVD與RUT含量合計(jì)為0.025 μg/mg，小于《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定的0.15%；樣品S24和S25的LIM的含量分別為0.041 μg/mg和0.056 μg/mg小于《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定的0.20%；吳茱萸樣品S33～S39果實(shí)大小2～6 mm，市售屬中花吳茱萸，其LIM含量為0，稱為中花樣吳茱萸劣品，推測(cè)其不合格可能與盲目引種或非道地產(chǎn)區(qū)種植有關(guān)。

非藥用部位或者雜質(zhì)也是導(dǎo)致中藥材不合格的主要原因之一，《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定吳茱萸雜質(zhì)不得超過7%。S20和S24枝、葉、果梗等雜質(zhì)超過藥典規(guī)定，S3辛辣味弱，略帶甜味，推測(cè)是摻糖以增加吳茱萸的質(zhì)量。

3.2 不同商品規(guī)格吳茱萸化學(xué)成分與肝細(xì)胞毒性的關(guān)系

課題組前期譜毒相關(guān)性結(jié)果表明EVD、MNQ和MUQ與L02細(xì)胞毒性具有相關(guān)性[10]。Li等[7]通過譜-毒相關(guān)性分析19批不同產(chǎn)地的35 g/kg吳茱萸50%乙醇提取物連續(xù)ig給予小鼠14 d的肝毒性與19批吳茱萸指紋圖譜的46個(gè)共有峰峰面積的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二氫吳茱萸次堿、EVC和1-甲基-2-[(6，9)-6,9-十五烷二烯基]-4(1)-喹諾酮等成分與吳茱萸所致肝毒性相關(guān)。Liang等[11]采用正交偏最小二乘法分析石油醚層、氯仿層、醋酸乙酯層、正丁醇層和水層色譜峰峰面積與連續(xù)ig小鼠0.87、1.73和3.46 g/kg吳茱萸7 d的肝毒性指標(biāo)ALT和AST的相關(guān)性，結(jié)果表明松柏苷、MUQ和EVC等成分與吳茱萸所致肝毒性有關(guān)。故在藥典規(guī)定的基礎(chǔ)上，本研究增加了具有代表性且含量較高的3種喹諾酮生物堿進(jìn)行含量測(cè)定，建立了UPLC法同時(shí)測(cè)定39批吳茱萸樣品中LIM、EVD、RUT、MNQ、MUQ和EVC含量，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，6種成分分離度較好。含量測(cè)定和細(xì)胞毒性結(jié)果表明，小花和中花吳茱萸中LIM含量較高，生物堿含量較低，毒性較小，而大花吳茱萸中LIM含量較低，生物堿含量較高，毒性較大，其中不含LIM的中花樣吳茱萸劣品毒性最大。課題組前期研究表明[12]，LIM預(yù)處理可降低吳茱萸致C57BL-6小鼠肝毒性，因此，LIM是吳茱萸質(zhì)量控制的關(guān)鍵標(biāo)志物。毒性較大的大花吳茱萸果實(shí)大小6～10 mm，果實(shí)成熟，開裂，LIM含量較低，且不符合《中國(guó)藥典》2020年版中吳茱萸為干燥近成熟果實(shí)及直徑2～5 mm大小的規(guī)定。綜合上述研究結(jié)果表明果實(shí)大小可作為區(qū)分毒性的依據(jù)，商品學(xué)分類在一定程度上反映吳茱萸的毒性。

綜上，應(yīng)基于藥典對(duì)于市場(chǎng)中不含LIM的中花樣吳茱萸劣品嚴(yán)格管控，避免其在市場(chǎng)上流通。大花吳茱萸中LIM含量低，生物堿含量高，毒性較大不適合入藥；而生物堿類成分同時(shí)也是藥效成分，小花吳茱萸中生物堿成分含量過低，故在臨床上，建議以中花吳茱萸入藥，這與市場(chǎng)上中花吳茱萸售價(jià)最高，普遍認(rèn)為品質(zhì)最好的評(píng)價(jià)一致，本實(shí)驗(yàn)為吳茱萸的質(zhì)量控制和其安全使用提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparison of effective components and hepatotoxicity in the different commercial grades of Euodiae Fructus

ZHANG Wei1, REN Kun1, WANG Dong-mei2, WU Shuang-feng1, QU Shou-he1, CHENG Xi-le1, REN Shu-meng1, PAN Ying-ni1, LIU Xiao-qiu1

1. School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, 110016, China 2. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning, 110016, China

To evaluate the quality of Wuzhuyu (Evodiae Fructus, EF) in the market, and study the correlation between components and hepatotoxicity of different commercial grades of EF, and provide the foundation for the quality control of EF.Seven batches of small flower EF (SEF), twenty-two batches of medium flower EF (MEF) and ten batches of big flower EF (BEF) were collected according to the commercial specifications of EF. The contents of limonin (LIM), evodiamine (EVD) and rutaecarpine (RUT) in 39 batches of EF samples were determined according to 2020 Edition of Chinese Pharmacopoeia. A UPLC method was established for the simultaneous determination of LIM, EVD, RUT, 1-methyl-2-nonyl-4(1)-quinolone (MNQ), 1-methyl-2-undecyl-4(1)-quinolone (MUQ), and evocarpine (EVC) in EF. The inhibitory effects of EF samples on L02 cells were detected by CCK-8 method. The principal component analysis (PCA) was performed on the basis of cell viability of 39 batches of EF samples to evaluate the differences toxicity of different categories of EF samples using SIMCA-P 14.1 statistical software.The results showed that there were 19 batches of EF meeting the requirements of Pharmacopoeia. Of the 20 batches of samples that do not meet the requirements of Pharmacopoeia, 10 batches were inconsistent with the original medicinal materials, EVD and RUT contents of one batch, and LIM contents of nine batches did not meet the requirements. One of seven batches SEF, ten of twenty-two batches MEF, and nine of ten batches BEF did not meet the requirements of Pharmacopoeia. At the same time, it was found that the LIM contents in SEF were higher than that in MEF and BEF, while the alkaloid contents were higher in MEF and BEF. Samples S33～S39 belonged to MEF but do not contain LIM according to the fruit size, which was called inferior products of MEF(IMEF). The method based on UPLC could be applied to determine LIM and five alkaloids in EF. The results of PCA suggested that 39 batches of samples were divided into four groups: SEF, MEF, BEF, IMEF. The inhibition effects of EF samples on L02 cell were IMEF＞BEF＞MEF＞SEF. The result also demonstrated that the ratio of contents of LIM to five alkaloids was positively correlated with the IC50of EF samples.The toxicity of EF was related to the ratio of LIM to 5 alkaloids. The greater the ratio of LIM to five alkaloids, the less toxic the EF was. It was suggested that BEF was not suitable for circulation as a commodity, and the proportion of LIM and alkaloids in EF should be considered in quality control.

Euodiae Fructus; commercial grades; UPLC; limonin; evodiamine; rutaecarpine; alkaloid; hepatotoxicity

R286

A

0253 - 2670(2021)17 - 5287 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.021

2021-07-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81773879）；遼寧省高等學(xué)校國(guó)（境）外培養(yǎng)項(xiàng)目（2018LNGXGJWPY-YB024）

張 薇（1992—），女，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及中藥質(zhì)量控制研究。Tel: (024)43520708 E-mail: 751305770@qq.com

劉曉秋，女，沈陽藥科大學(xué)50期中藥學(xué)專業(yè)校友，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)中藥化學(xué)專業(yè)委員會(huì)理事，主持國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目3項(xiàng)，主持完成省部級(jí)項(xiàng)目10余項(xiàng)（其中為2010版藥典起草項(xiàng)目3項(xiàng)）。獲國(guó)家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步二等獎(jiǎng)及國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)進(jìn)步三等獎(jiǎng)各1項(xiàng)，獲得國(guó)家級(jí)中藥新藥證書2個(gè)，申請(qǐng)專利授權(quán)3項(xiàng)。Tel: (024)43520708 E-mail: liuxiaoqiu3388@126.com

潘英妮，女，碩士生導(dǎo)師，沈藥64 期中藥學(xué)專業(yè)校友，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制和藥效物質(zhì)研究。全國(guó)中藥特色技術(shù)傳承人才，遼寧省中藥特色技術(shù)傳承人才，世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)滿藥專業(yè)委員會(huì)常務(wù)理事，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥炮制分會(huì)委員。主持完成國(guó)家自然基金青年基金項(xiàng)目1項(xiàng)，第四次全國(guó)中藥資源普查項(xiàng)目2項(xiàng)，遼寧省教育廳項(xiàng)目3項(xiàng)。）Tel: (024)43520711 E-mail: panyingni@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]