血清4型和5型副豬嗜血桿菌易感仔豬發(fā)病模型的建立

宋曉明，董紹明，李佃場，宋 杰，王 森，張洪亮，秦曉冰，單 虎

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東省新獸藥創(chuàng)制協(xié)同創(chuàng)新中心，山東青島 266109；2.乳山市行政審批服務局，山東乳山 264500；3.即墨區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務中心，山東青島 266200）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS），屬于巴斯德菌科（Pastteurellaceae）嗜血桿菌屬（Haemophilus），為革蘭氏陰性菌，是仔豬上呼吸道早期定居的菌群成員之一。該菌可引起以豬的多發(fā)性漿膜炎、纖維素性胸膜炎、腦膜炎、腹膜炎、心包炎和關(guān)節(jié)炎等多器官病變?yōu)樘卣鞯母必i嗜血桿菌病，又稱格拉塞爾氏病[1]。該病在各年齡段豬群中均有發(fā)生，斷奶和保育仔豬比較易感，5～8 周齡仔豬的發(fā)病率為10%～15%，發(fā)病嚴重的養(yǎng)殖場死亡率可達50%以上。HPS 呈世界性分布，危害范圍比較廣，與其他細菌、病毒等多病原混合感染情況嚴重。作為豬群一種主要的繼發(fā)病原，HPS 對國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成了不良影響。據(jù)報道[2]，HPS 臨床分離株表現(xiàn)出對幾種抗生素的抗性。因此，接種疫苗和血清抗體（IgG 或IgA）是控制該病的有效手段[3-4]。但由于HPS 血清型多樣化且不同血清型菌株毒力差異較大，導致不同血清型菌株間交叉保護作用差，疫苗接種失敗的發(fā)生率很高[5-7]。為解決上述問題，有必要構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的易感仔豬感染模型，從而為HPS 致病機制、診斷和免疫研究奠定技術(shù)基礎。

1 材料與方法

1.1 HPS 菌株

HPS 血清4型SD-05、ZC-7 株，血清5型HB-08、PZ-26 株，均由本實驗室分離并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基以及主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），購自英國OXOID 公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），購自Sigma 公司；新生牛血清，購自浙江天杭生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker、ExTaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 試驗動物

21～28 日齡健康易感仔豬100 頭，由試驗定點豬場提供，經(jīng)HPS 正向間接血凝診斷試劑盒檢測確認，抗體呈陰性。

1.4 毒力測定

1.4.1 分離株復蘇培養(yǎng) 將HPS 血清4型（SD-05、ZC-7）、5型（HB-08、PZ-26）菌株分別接種在添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSA固體培養(yǎng)基上復蘇，連續(xù)傳至第3 代；無菌條件下挑取單菌落至5 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)10～12 h，作為種子液；將種子液按照2%接種量接種至100 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min擴大培養(yǎng)10～12 h；應用平板菌落計數(shù)法進行活菌計數(shù)，并將菌液在4 ℃條件下9 000 r/min 離心10 min，棄上清后以PBS 分別稀釋成不同濃度進行毒力測定。

1.4.2 分離株毒力測定 對于每種分離株，選取20 頭健康仔豬開展試驗。將仔豬隨機分成4 組（A—D），每組5 頭。其中A—C 為試驗組，D 為對照組。對試驗組仔豬腹腔注射不同濃度菌株，每頭2.0 mL，同時對D 組仔豬注射PBS 作為對照，觀察14 d。記錄試驗組發(fā)病情況，根據(jù)毒力測定結(jié)果選取毒力較強的菌株用于仔豬感染試驗。

1.5 仔豬感染試驗

分別以1.4.2 試驗中得到的血清4型、5型最適菌株最適劑量，對5 頭試驗仔豬進行腹腔注射，每頭2.0 mL，另外5 頭仔豬注射PBS 作為對照。觀察感染后仔豬臨床癥狀，記錄仔豬發(fā)病及死亡情況，對死亡豬只進行剖解，觀察其心、肝、脾、肺、腎等組織器官的病理變化。

1.6 HPS 分離鑒定

1.6.1 HPS 分離培養(yǎng) 無菌條件下分別采集感染血清4型、5型菌株死亡仔豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、心包積液、心血、關(guān)節(jié)液、腹腔積液、胸腔積液等組織病料，并接種于含0.005%NAD 和5%新生牛血清的TSA、TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取疑似單菌落進一步純化培養(yǎng)。

1.6.2 引物設計與合成 根據(jù)GenBank 中HPS 16s rRNA基因序列（登錄號：M75065）設計引物（上游：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'；下游：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGTA-3'）。預計擴增目的片段大小為822 bp，引物送北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.6.3 PCR 擴增 取鏡檢無雜菌污染的菌液1 mL，用高速離心機10 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液；沉淀用雙蒸水溶解，再將其100 ℃煮沸15 min；12 000 r/min 離心5 min，收集上清作為模板用于PCR 擴增。反應體系為25.0 μL：上、下游引物各0.8 μL，細菌DNA 模板2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，雙 蒸 水16.5 μL，dNTP 2.0 μL，rTaq酶0.4 μL。反應條件：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，循環(huán)30 次；終延伸72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析。

2 結(jié)果

2.1 毒力測定

2.1.1 血清4型菌株 由表1～2可以看出，HPS血清4型分離株SD-05和ZC-7以攻毒劑量（1.1～1.2）×109CFU注射后，在14 d 內(nèi)SD-05株可使2/5 仔豬發(fā)病，ZC-7 株則不能導致仔豬發(fā)?。患哟蠊ザ緞┝恐粒?.4～4.8）×109CFU 時，SD-05 株可使仔豬全部發(fā)病，并導致3/5 仔豬死亡，而ZC-7 株只有3/5 仔豬發(fā)病，2/5 仔豬死亡；當劑量增加至（8.8～9.6）×109CFU 時，SD-05 株可導致4/5仔豬死亡，ZC-7株只引起3/5仔豬死亡。因此，推測血清4型SD-05 株毒力較強。為保證易感仔豬感染模型中同時有發(fā)病和死亡病例，選擇SD-05株最適感染劑量為4.8×109CFU。

表1 血清4型菌株SD-05 株對健康易感斷奶仔豬毒力測定結(jié)果

表2 血清4型菌株ZC-7 株對健康易感斷奶仔豬毒力測定結(jié)果

2.1.2 血清5型菌株 由表3～4 可以看出，血清5型分離株HB-08 和PZ-26 以攻毒劑量（1.1～1.175）×109CFU 注射時，在14 d 內(nèi)，HB-08 株可使3/5 仔豬發(fā)病，PZ-26 株可使2/5 仔豬發(fā)??；加大劑量至（4.4～4.7）×109CFU 時，HB-08 株可使全部仔豬發(fā)病，并導致4/5 仔豬死亡，PZ-26 株也可使全部仔豬發(fā)病，但只引起2/5 仔豬死亡；當進一步加大攻毒劑量至（8.8～9.4）×109CFU 時，HB-08 株可引起仔豬全部死亡，PZ-26 株只引起3/5 仔豬死亡。因此，推測血清5型HB-08 株毒力較強。同樣地，為保證易感仔豬感染模型中同時有發(fā)病和死亡病例，選擇HB-08 株最適感染劑量為4.7×109CFU。

表3 血清5型菌株HB-08 株對健康易感斷奶仔豬毒力測定結(jié)果

2.2 感染仔豬病理變化

2.2.1 感染血清4型SD-05 株 感染后，仔豬體溫升高，出現(xiàn)精神沉郁、呼吸困難、咳嗽、消瘦、跛行、可視黏膜發(fā)紺等臨床癥狀。剖檢可見胸腹腔內(nèi)和各臟器表面有纖維素性滲出物，心臟出現(xiàn)“絨毛心”等病理變化（圖1）。

圖1 仔豬感染HPS 血清4型SD-05 株后剖檢變化

表4 血清5型菌株P(guān)Z-26 株對健康易感斷奶仔豬毒力測定結(jié)果

2.2.2 仔豬感染血清5型HB-08 株 仔豬感染血清5型HB-08 株后的臨床表現(xiàn)及剖解變化（圖2）與感染血清4型SD-05 株基本相同。

圖2 仔豬感染HPS 血清5型HB-08 株后剖檢變化

2.3 PCR 鑒定

將分離到的血清4型SD-05 株、血清5型HB-08 株經(jīng)PCR 特異性擴增，得到822 bp 的目的片段（圖3），與預期片段大小一致。

圖3 HPS 血清4型（SD-05）、5型（HB-08）分離株P(guān)CR 產(chǎn)物擴增結(jié)果

3 討論

副豬嗜血桿菌病的特征性病變是通過細菌全身性侵襲從而產(chǎn)生纖維性多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。HPS 能夠通過粘附和侵襲上皮細胞而定居并引發(fā)感染，通過降解IgA，逃避先天免疫系統(tǒng)，并在宿主內(nèi)部繁殖產(chǎn)生強烈炎癥反應[8-9]。HPS 可誘導CD163+單核細胞呈比例增加，產(chǎn)生大量TNF-α、IL-1 和IL-6 等促炎細胞因子，并誘導上皮和內(nèi)皮細胞的凋亡和白介素IL-6 和IL-8 的釋放[10]，這些細胞因子在該病典型病變的炎癥反應和發(fā)展中起作用。豬肺泡巨噬細胞的吞噬作用可消除HPS 非毒力菌株的感染，但其強毒株能夠逃避巨噬細胞的吞噬[11]。HPS 強毒株一旦進入血液，就能以抗體非依賴性方式避免補體介導的殺傷，因此能夠到達全身各部位，引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎[12]。

不同國家或地區(qū)存在的HPS 血清型不同，菌株的毒力差異也很大。我國流行的HPS 主要血清型為4型和5型，其次是12型、13型、14型等，但個別地區(qū)間略有差異[13-18]。本試驗發(fā)現(xiàn)，HPS不同血清型以及相同血清型的不同菌株對21～28 日齡健康易感斷奶仔豬的毒力也不相同。綜合試驗數(shù)據(jù)，HPS 血清4型SD-05 株和血清5型HB-08 株毒力較強，對仔豬建立發(fā)病模型的最適接種劑量分別為4.8×109、4.7×109CFU。

SD-05 株和HB-08 株可導致仔豬體溫升高，使其出現(xiàn)精神沉郁、呼吸困難、咳嗽、消瘦、跛行、可視黏膜發(fā)紺等臨床癥狀；剖檢可見，胸腹腔內(nèi)以及心臟、肺臟、腎臟、脾臟等臟器表面有纖維素性滲出物，心臟出現(xiàn)“絨毛心”等病理變化，以上癥狀及病理變化為副豬嗜血桿菌病的特征性病變，且隨后在攻毒死亡仔豬組織器官中成功分離到HPS 血清4型SD-05 株和血清5型HB-08 株。綜上，本研究初步建立了血清4型和5型HPS 感染的仔豬發(fā)病模型，可應用于新獸用生物制品的安全性和免疫效力評價。在后續(xù)研究中，需進一步豐富完善更多指標，擴大該模型的應用范圍。本研究為HPS 致病機制、診斷和免疫研究奠定了基礎。