黃瀟航，王詩晨，李詩藝，賀金峪，張 龍，宋肇程，黃志堅，殷光文

（1.福建農(nóng)林大學動物科學學院（蜂學學院），福建福州 350002；2.福建省動物藥物工程實驗室，福建福州 350002；3.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013）

線蟲為臨床危害較大的寄生蟲類群，蛔蟲歸屬其中。動物蛔蟲病的發(fā)生會降低動物的生產(chǎn)性能，影響膘情、生長發(fā)育等多方面的機體功能。在醫(yī)學臨床上，蛔蟲幼蟲在腸道發(fā)育階段會發(fā)生肺、肝等部位的蚴蟲移行癥狀，造成宿主的機械性損傷甚至死亡。蛇蛔蟲病是由蛇蛔蟲引起的寄生蟲病，主要導致蛇群出現(xiàn)消化系統(tǒng)癥狀，多量寄生時會造成蛇群生長遲緩，甚至死亡。

在對珍稀或者特種經(jīng)濟野生動物疾病防治上，開展蛔蟲的種類鑒定、致病危害等方面研究對于蛔蟲病臨床治療、疫苗研發(fā)等具有非常重要的公共衛(wèi)生意義。分子生物學鑒定技術近年來逐漸成為物種種類鑒定研究的熱門方向，其中細胞色素氧化酶C-I 區(qū)片段（cox1）被廣泛應用于鳥類、獸類等動物遺傳鑒定的重要遺傳鑒定區(qū)。寄生蟲作為地球上存在的較為古老的種群，其種群遺傳對于近現(xiàn)代物種演化研究具有非常重要的參考價值。我國在蛔蟲種類鑒定上也由傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察鑒定逐漸向分子遺傳鑒定發(fā)展，在豬蛔蟲、雞蛔蟲等傳統(tǒng)畜禽蛔蟲的分子遺傳學領域，如nad4、cox3等遺傳區(qū)間的擴增，已取得了一定的分子數(shù)據(jù)積累，但在野生動物寄生蟲方面的研究較少。

cox1是蛔蟲線粒體內(nèi)的一段具有較高種間保守性且遺傳穩(wěn)定的母源遺傳基因片區(qū)，目前多項報道支持其在黃鱔胃瘤線蟲、獅弓首蛔蟲、雞蛔蟲等分子遺傳學研究中的重要種類鑒定意義，也被逐漸廣泛應用于線蟲等蠕蟲的種群遺傳研究。

2019年底福建省南平市某蛇類養(yǎng)殖場暴發(fā)蛇蛔蟲病，病蛇表現(xiàn)為消瘦、拒食等癥狀，剖檢后可見腸道及胃部鄰界處寄生大量蛔蟲。本研究在原先臨床案例[1]基礎上，對送檢的大王蛇體內(nèi)分離獲得的蛇蛔蟲進行DNA 提取，使用PCR 擴增和分子測序技術，對cox1基因進行分子鑒定，明確其種屬差異性，以期為福建省蛇蛔蟲病防治積累相關的基礎性研究資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛇蛔蟲蟲體，保存于-20℃，70%乙醇溶液中；DNA 提取試劑盒FastDNA SPIN Kit，美國MP Biomedicals 公司生產(chǎn)；EasyTaqMix 聚合酶，全式金生物公司生產(chǎn)；引物JB3.0、JB4.5，上海生工生物工程股份有限公司合成；DNA 膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit，北京全式金生物技術有限公司生產(chǎn)；Veriti 梯度PCR 儀，Applied Biosystems 公司生產(chǎn)；Omega Fluor Plus 藍光凝膠成像系統(tǒng)，美國Aplegen 公司生產(chǎn)。

1.2 試驗步驟

1.2.1 DNA 提取 選取3 條蛇蛔蟲雌蟲，編號為S1—S3，截取蟲體1 cm 頭部組織，使用DNA Fast Kit 試劑盒，參照使用說明書對處理后的蟲體組織進行DNA 提取，提取后除試驗用量之外，將剩余DNA 放入-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成 參考文獻[2]合成引物序列（表1），由上海生工有限公司合成制備。

表1 引物序列

1.2.3 PCR 擴增 使用PCR 擴增目的片段，使用ddH2O 作為陰性對照。搭配反應體系為25.0 μL：DNA 模板4.0 μL，ddH2O 6.5 μL，上下游引物各1.0 μL，EasyTaqMix 酶12.5 μL。反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。為提高PCR 擴增的產(chǎn)物量，將第1 輪獲得的擴增陽性條帶使用膠回收后獲得純化DNA 模板，開展第2 輪PCR 擴增。

1.2.4 凝膠電泳成像 將擴增后的PCR 產(chǎn)物加入瓊脂糖電泳孔中進行電泳，設定電壓150 V、電流100 mA，進行30 min 電泳后，將產(chǎn)物移至紫外凝膠成像儀中進行陽性條帶觀察，并拍照記錄。

1.2.5 陽性產(chǎn)物切膠回收 將獲得的陽性條帶在紫外儀下精準切割后，使用膠回收試劑盒回收純化產(chǎn)物DNA，送往福州鉑尚生物科技有限公司進行產(chǎn)物測序鑒定。測序采用Sanger 雙向測序，測序試劑盒為Abi 試劑盒。

1.2.6 純化產(chǎn)物測序 測序結果返回后，使用DNAstar 7.0 等生物分析軟件進行生物遺傳堿基序列差異性比對分析。

2 結果與分析

2.1 凝膠電泳成像

從凝膠電泳成像圖（圖1）來看，使用的DNA Marker 標識度為2 000 bp，獲得S1—S3 樣品擴增的cox1大小片段在450 bp 左右，作為空白對照的陰性樣品無條帶產(chǎn)生。

圖1 蛇蛔蟲的cox1 擴增結果

2.2 DNA 序列分析

對從生物公司返回的S1—S3 序列進行分析比對，發(fā)現(xiàn)獲得的目的片段大小約443 bp（圖2），GC 百分比為35.66%～35.89%。獲取測序序列后，將其與NCBI 中登錄的物種數(shù)據(jù)進行比對發(fā)現(xiàn)：所獲得蛇蛔蟲與早前報道于上海的蛇絲狀蛔 蟲（Ophidascaris filaria，MH285590.1）序 列同源性最高（圖3），為99.1%～99.3%；其次為Toxascaris leonina（AJ920063.1）、Baylisascaris columnaris（MH795148.1），同源性分別為90.7%～90.9%、90.8%～91.0%；與其他蟲種同源性為87.0%～90.0%，差異較大。結合分子生物學和早前臨床形態(tài)學觀察等結果，表明暴發(fā)于福建省南平市某蛇類養(yǎng)殖場蛇蛔蟲病的主要致病原為蛇絲狀蛔蟲。

通過與已登錄的蛇蛔蟲（MH285590.1，OF）序列進行比較，發(fā)現(xiàn)S1—S3 分離株在基因位點遺傳上表現(xiàn)為不同基因區(qū)的堿基突變（圖2）。S1—S3 與OF 存在差異的位點主要表現(xiàn)為3 個位點的堿基突變：依次為11 位點的G-C 突變，68位點T-C 突變，433 位的C-T 突變，其余堿基序列基本相同。借助DNAstar 7.0 中的MeAlign 分析，對參與比對的蛇蛔蟲S1—S3、OF 以及雞蛔蟲（KX266846.1）、浣熊貝蛔蟲（MH795148.1）、對盲囊線蟲（FJ416643.1、FJ866816.1）等蟲種序列進行比較，發(fā)現(xiàn)S1—S3 序列與OF 具有最高的種間親緣性，且都超過99.0%，而與對盲囊線蟲等的cox1同源性均低于95.0%（圖3）。

圖3 使用DNAstar 7.0 軟件制備的同源性對比結果

2.3 進化樹分析

通過序列比對發(fā)現(xiàn)，分離自福建省的蛇蛔蟲除與現(xiàn)已報道的蛇蛔蟲（MH285590.1，OF）同源性為99.1%～99.3%外，與其他已報道的動物蛔蟲具有較大的遺傳差異性，因此通過Mega7.0 軟件將序列裁剪后采用Bootstrap 比對1 000 次，采用Neighbour Joining 方法制備系統(tǒng)進化樹。將報道的Strongyloides（LC535118.1）作為構樹的遺傳外類群，構建了蛇蛔蟲種系進化樹。樹圖構建分析結果（圖4）顯示，分離自南平市蛇類養(yǎng)殖場的分離株S1—S3 在進化樹樹枝分化上形成聚合分支，且與NCBI 報道的蛇絲狀蛔蟲聚于一支，與基因同源性分析結果相符合。在外枝周圍，蛇蛔蟲分支與Toxascaris leonina（AJ920063.1），Parascaris univalens（MK209671.1），Contracaecum rudolphii（FJ866816.1）等近源線蟲分散在不同遺傳分支且差距較大。綜上，本次分離鑒定的蛇蛔蟲在分子生物學上屬于蛇絲狀蛔蟲，與其他動物寄生蛔蟲具有較大的種間差異性。

圖4 蛇蛔蟲南平分離株（NJ）進化樹

3 討論

在蛇類線蟲分子生物學鑒定方面，關于福建省蛇類寄生蟲方面的研究甚少。國際上對蛇蛔蟲開展的種類鑒定主要集中在形態(tài)學鑒定上[3-4]，也有掃描電鏡的相關報道[5]。在相關臨床案例中，有報道[6]在患有腫瘤病蟒蛇的胃部分離到蛇絲狀蛔蟲，這也是為數(shù)不多的使用分子診斷技術鑒定蛇蛔蟲的案例報道。

cox1本身是一種對于多數(shù)線蟲都能進行擴增研究的重要母系遺傳區(qū)間，具有片段小、保守、種間差異顯著的特點。國內(nèi)相關研究多停留在形態(tài)學領域上，而使用分子生物學技術研究蛇蛔蟲的相關報道較少。通過cox1擴增，對引發(fā)蛇場疫情的蛔蟲種類進行鑒定，發(fā)現(xiàn)3 株蛇蛔蟲的cox1同源性為99.5%～99.8%（圖3），存在2 處堿基的變化差異，與上海市蛇絲狀蛔蟲的cox1同源性為99.1%～99.3%，存在較少堿基差異，提示蛇絲狀蛔蟲地域株在cox1種內(nèi)遺傳差異上較為保守。S1—S3 與雞蛔蟲、對盲囊線蟲等線蟲同源性低于種間同源性，因而利用cox1能夠較好地區(qū)別蛇蛔蟲。

福建省在蛇類寄生蟲病研究方面的報道較少，而本項研究為福建省蛇類蛔蟲分子分類鑒定提供了相關佐證，同時進一步驗證了細胞色素氧化酶cox1片段具有種間高度保守性，從而說明對該片段的擴增分析能夠為蛇蛔蟲分子生物學分類鑒定提供有效的輔助手段。