黃曉麗，吳松，黃麗，王鵬，陳中祥，覃東立,3*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150076；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黑龍江流域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，黑龍江 哈爾濱 150076；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141)

稻漁綜合種養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、資源開(kāi)發(fā)和環(huán)境保護(hù)相互協(xié)調(diào)發(fā)展的生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)模式之一[1]。近年來(lái)，稻漁綜合種養(yǎng)模式得到大力扶持和推廣，2019年養(yǎng)殖面積達(dá)231.75 萬(wàn)hm2，產(chǎn)量超過(guò)290萬(wàn)t[1]。隨著稻漁綜合種養(yǎng)產(chǎn)業(yè)規(guī)模的提高，稻田病蟲(chóng)草害防治過(guò)程中施藥與養(yǎng)殖生物生長(zhǎng)風(fēng)險(xiǎn)及質(zhì)量安全之間的矛盾日益突出[2-3]。農(nóng)藥不僅對(duì)水生動(dòng)物具有致死效應(yīng)，還影響其個(gè)體發(fā)育、生殖及行為[4-5]，導(dǎo)致生物體組織病理變化[6-7]，引起生物體脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和相關(guān)抗氧化酶活力變化等[8-9]。因此，系統(tǒng)評(píng)估稻田施用農(nóng)藥對(duì)養(yǎng)殖生物的毒性效應(yīng)對(duì)于科學(xué)養(yǎng)殖及指導(dǎo)生產(chǎn)具有重要意義。

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是中國(guó)重要經(jīng)濟(jì)甲殼類(lèi)養(yǎng)殖品種之一。稻蟹種養(yǎng)在東北地區(qū)發(fā)展較快，2019年?yáng)|北三省稻田養(yǎng)殖面積超過(guò)1533.33 km2，遼寧省盤(pán)錦市是中國(guó)北方最大的中華絨螯蟹養(yǎng)殖基地[10]。中華絨螯蟹的生長(zhǎng)、代謝及繁殖受溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽濃度、重金屬、有機(jī)污染物等環(huán)境因素影響較大[11-14]。水稻種植過(guò)程中廣泛使用的除草劑已被證實(shí)對(duì)中華絨螯蟹具有急性毒性，有學(xué)者在殘留效應(yīng)、組織病理等方面開(kāi)展了相關(guān)研究[15-18]。苯噻酰草胺是一種在東北地區(qū)廣泛使用的高效、高選擇性的觸殺性除草劑，對(duì)水生生物的直接毒性較低，但可轉(zhuǎn)換為毒性較強(qiáng)的二烷基醌亞胺[19]。該農(nóng)藥能夠誘發(fā)斑馬魚(yú)(Brachydanioreriovar)紅細(xì)胞核異變，具有遺傳毒性[20]；與其他化合物聯(lián)合作用時(shí)對(duì)水蚤毒性較大[21]，但其對(duì)中華絨螯蟹幼蟹的急性毒性尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)合除草劑施用的實(shí)際情況，以中華絨螯蟹幼蟹作為研究對(duì)象，采用半靜態(tài)體外暴露法，考察了中華絨螯蟹幼蟹短期暴露于苯噻酰草胺14 d過(guò)程中蟹體內(nèi)鰓和肝胰腺組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)的含量變化，綜合評(píng)價(jià)了苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹幼蟹的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和相關(guān)抗氧化酶系統(tǒng)的影響，旨在為稻漁綜合種養(yǎng)模式中農(nóng)藥施用及科學(xué)養(yǎng)殖提供參考數(shù)據(jù)及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

因稻田中苯噻酰草胺的施用時(shí)間在每年的5月，因此本研究選擇的受試生物為農(nóng)藥施用期的中華絨螯蟹幼蟹。實(shí)驗(yàn)用中華絨螯蟹幼蟹購(gòu)自遼寧省盤(pán)錦市養(yǎng)殖基地，體重為(20.56±2.40)g。正式實(shí)驗(yàn)前將購(gòu)買(mǎi)的中華絨螯蟹幼蟹于充分曝氣的自來(lái)水中暫養(yǎng)2周，平均水溫(25±2)℃，pH為6.55～7.53，暫養(yǎng)期間正常投喂。暫養(yǎng)后隨機(jī)選取規(guī)格一致、健康有活力、體色正常、無(wú)外傷、附肢健全的幼蟹進(jìn)行毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

U-4100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立)、DZKW-4恒溫水浴箱(北京永光明)、Allegra X-30R低溫冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter)、VORTEX 3漩渦混勻器(德國(guó)IKA)、T25組織勻漿機(jī)(德國(guó)IKA)。供試藥品為純度98%的苯噻酰草胺粉末狀原藥，購(gòu)于江西眾和生物科技有限公司；丙酮(分析純)，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所需的SOD、CAT、MDA和蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在玻璃缸(長(zhǎng)35 cm×寬15 cm×高25 cm)中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣自來(lái)水，水溫在24～28 ℃之間、pH在6.57～7.68之間，24 h連續(xù)曝氣，水體溶解氧(DO)保持在6.0 mg/L以上，實(shí)驗(yàn)期間不投喂。實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)體外暴露法，首先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定幼蟹的24 h全死亡濃度(10 mg/L)和96 h無(wú)死亡濃度(0.01 mg/L)。在0.01～10.00 mg/L的濃度之間，按照等比級(jí)數(shù)設(shè)6個(gè)濃度梯度(0.01、0.04、0.16、0.64、2.50 和10.00 mg/L)，并設(shè)置空白對(duì)照組(曝氣自來(lái)水)以及助溶劑(丙酮)對(duì)照組，每個(gè)濃度組設(shè)4 個(gè)平行。每個(gè)玻璃缸放入6只中華絨螯蟹幼蟹，以96 h為一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，每24 h更換一次實(shí)驗(yàn)溶液。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，定時(shí)觀察幼蟹的存活狀況，測(cè)定水體pH、DO和溫度，分別記錄幼蟹在24、48、72及96 h時(shí)的行為變化和死亡情況，及時(shí)撈出死亡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.4 相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定

急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，繼續(xù)在相同的條件下進(jìn)行氧化應(yīng)激指標(biāo)考察實(shí)驗(yàn)。分別于實(shí)驗(yàn)的0、4、10和14 d，從各濃度組取出3～4只存活的幼蟹。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，0.63、2.51、10.00 mg/L苯噻酰草胺濃度組的受試幼蟹全部死亡，因此不進(jìn)行分析。幼蟹置于冰上，迅速解剖取出鰓和肝胰腺組織，經(jīng)預(yù)冷的PBS緩沖溶液淋洗，用濾紙吸收組織表面水分。稱取0.2 g采集的組織樣品，用預(yù)冷的0.86%生理鹽水以1∶9(W∶V)的配比冰浴勻漿，5 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)、SOD、CAT和MDA，具體操作步驟按照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。組織中可溶性蛋白質(zhì)含量，抗氧化指標(biāo)SOD、CAT 活性及MDA含量的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒的方法測(cè)定。

1.5 半致死濃度(LC50)與安全濃度(SC)計(jì)算

采用寇氏法計(jì)算苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹幼蟹的半致死濃度(LC50)[21]。計(jì)算公式如下：

LgLC50=Xm-i(∑P-0.5)

式(1)

安全濃度(Safe concentration，SC)計(jì)算公式如下[22]：

SC=LC50(96h)×0.1

式(2)

其中，LgLC50為半致死濃度10為底的對(duì)數(shù)值，Xm為最大處理濃度的對(duì)數(shù)值，i為相鄰組濃度對(duì)數(shù)差，∑p為各濃度組死亡率總和。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(X ± SE)表示，利用Prism 7.0 軟件繪制圖片，SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用單因素方差分析法(One-way ANOVA)分析急性脅迫引起的各不同濃度梯度間差異，以P<0.05為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹幼蟹的急性毒性

不同濃度苯噻酰草胺脅迫下的中華絨螯蟹幼蟹隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)了不同程度的中毒癥狀。實(shí)驗(yàn)期間，空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組均無(wú)中毒和個(gè)體死亡現(xiàn)象，且活力正常。在0.01 mg/L濃度脅迫下，整個(gè)過(guò)程中大多數(shù)個(gè)體都較活潑，個(gè)別個(gè)體出現(xiàn)了輕微中毒癥狀；在0.04 mg/L濃度組暴露初期，與對(duì)照組相比幼蟹無(wú)異常行為，暴露72 h后出現(xiàn)游動(dòng)變緩、反應(yīng)遲鈍等中毒癥狀；在0.16和0.63 mg/L苯噻酰草胺濃度組的幼蟹暴露48 h后逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、抱團(tuán)、附肢脫落和個(gè)體死亡的中毒現(xiàn)象。高濃度苯噻酰草胺脅迫對(duì)幼蟹具有明顯的毒性作用，在10.00 mg/L濃度脅迫下，幼蟹在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)躁動(dòng)不安、游動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象，然后逐漸出現(xiàn)抱團(tuán)、部分附肢脫落、腹部上翻及軀體僵直的中毒癥狀，暴露72 h后90%以上的個(gè)體死亡。

幼蟹的死亡數(shù)與苯噻酰草胺溶液間具有明顯的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。隨著苯噻酰草胺濃度的升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，中華絨螯蟹的存活率明顯下降，死亡率增加。脅迫24 h 時(shí)，≤2.51 mg/L濃度組中幼蟹死亡率低于20%，而10.00 mg/L濃度組中幼蟹死亡率達(dá)41 %，與其他組別的死亡率存在顯著性差異(P<0.05)。脅迫48 h時(shí)，≤2.51 mg/L濃度組幼蟹死亡率低于25%，而10.00 mg/L濃度組幼蟹死亡率達(dá)62%，與其他組別的死亡率存在顯著性差異(P<0.05)；脅迫96 h 后，≤0.63 mg/L濃度組幼蟹死亡率≤50%，2.51 mg/L濃度組死亡率達(dá)95%，10.00 mg/L濃度組中，幼蟹全部死亡(表1)。在脅迫72 h和96 h條件下，2.51 和10.00 mg/L濃度組與其他組別的死亡率存在顯著性差異(P<0.05)。數(shù)據(jù)分析獲得苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹幼蟹脅迫24、48、72、96 h的LC50分別為5.31、2.11、0.47和0.18 mg/L(表1)，安全濃度為0.018 mg/L。

表1 苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹幼蟹的急性毒性Tab.1 Acute toxicity of mefenacet on the juveniles Chinese mitten crab

2.2 苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹幼蟹鰓組織中SOD、CAT活力及MDA含量的影響

鰓組織中的SOD活力隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)(圖1)，各濃度組均在第4 d達(dá)到峰值，且隨暴露濃度升高而增加。脅迫第4 d的SOD活力與對(duì)照組相比均有升高，0.04和0.16 mg/L濃度組SOD活力顯著高于其他濃度組(P<0.05)。在脅迫第10 d，0.01和0.04 mg/L濃度組SOD活力與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，0.16 mg/L濃度組顯著增加。在脅迫第14 d，各濃度組SOD活力略高于對(duì)照組但無(wú)顯著性差異。鰓中CAT活力與SOD活力呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)(P<0.05)，隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)。各濃度組的CAT活力均在第4 d達(dá)到峰值，并隨暴露濃度升高而增加。在脅迫第4 d，各濃度組間CAT活力無(wú)顯著差異。在脅迫第10 d，0.01和0.04 mg/L濃度組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，0.16 mg/L 濃度組中CAT活力顯著低于對(duì)照組和其他濃度組(P<0.05)。脅迫第14 d，0.04和0.16 mg/L濃度組顯著低于對(duì)照組和其他濃度組(P<0.05)。不同濃度苯噻酰草胺對(duì)幼蟹鰓組織抗氧化效應(yīng)的影響存在一定的差異。0.01、0.04 mg/L濃度組，鰓中的MDA含量隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，但峰值出現(xiàn)的時(shí)間不同。各濃度組MDA含量波動(dòng)較大，在脅迫14天后，各濃度組間無(wú)顯著性差異。

圖1 中華絨螯蟹幼蟹鰓中SOD、CAT活力及MDA含量的影響同一處理時(shí)間下，不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)，下同F(xiàn)ig.1 The mefenacet effects on SOD activity,CAT activity and MDA concentration in gill of juveniles Chinese mitten crabUnder the same processing time,different letters mean with significant difference (P<0.05),the same below.

2.3 苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺組織中SOD、CAT活力及MDA含量的影響

幼蟹肝胰腺組織中SOD、CAT活力及MDA含量隨苯噻酰草胺濃度變化的趨勢(shì)與鰓組織中的有所不同。肝胰腺組織中SOD活力隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈上升-下降的波動(dòng)變化趨勢(shì)，各濃度組均在脅迫第10 d達(dá)最高值，這與鰓組織中的結(jié)果明顯不同。脅迫10 d后，不同苯噻酰草胺濃度下SOD活力均高于2個(gè)對(duì)照組，且具有顯著性差異(P<0.05)。肝胰腺中CAT活力對(duì)苯噻酰草胺濃度變化反應(yīng)敏感(圖2)，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)。不同苯噻酰草胺濃度處理組肝胰腺中的CAT活力與對(duì)照組相比均有升高，0.04和0.16 mg/L脅迫濃度下差異顯著(P<0.05)。隨著苯噻酰草胺濃度從0 升至0.16 mg/L，CAT活力表現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，在苯噻酰草胺濃度為0.16 mg/L時(shí)達(dá)最高值。肝胰腺組織中的MDA含量隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)基本上呈升高趨勢(shì)，且隨著暴露濃度升高而增加。在0.04和0.16 mg/L脅迫濃度下，脅迫14 d內(nèi)肝胰腺組織中MDA含量與對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)(圖2)。

圖2 中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺中SOD、CAT活力及MDA含量的影響Fig.2 The mefenacet effects on SOD activity,CAT activity and MDA concentration in hepatopancreas of juveniles Chinese mitten crab

3 討論

3.1 苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹的急性毒性

苯噻酰草胺對(duì)水生生物具有較為顯著的毒性[23-24]，對(duì)不同水生動(dòng)物產(chǎn)生的急性致死效應(yīng)不同。苯噻酰草胺對(duì)日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)、蘇拉威西秀體溞(Diaphanosomacelebensis)、褶皺臂尾輪蟲(chóng)(Brachionusplicatilis)的24 h LC50分別為30.39、23.01和50.00 mg/L[23]，對(duì)熱帶蝌蚪的24、48、72和96 h LC50值分別為3.06、2.95、2.79和2.70 mg/L[24]，對(duì)鯉(Cyprinuscarpio)的96 h LC50為6.0 mg/L[25]。本研究中苯噻酰草胺對(duì)幼蟹的24、48、72和96 h LC50值分別為5.31、2.11、0.47和0.18 mg/L，可見(jiàn)甲殼類(lèi)等無(wú)脊椎動(dòng)物比魚(yú)類(lèi)對(duì)苯噻酰草胺更敏感。參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[21]，苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹幼蟹的毒性等級(jí)為高毒(0.1 mg/L

苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹幼蟹毒性的濃度-效應(yīng)明顯，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)LC50越小，且在急性毒性實(shí)驗(yàn)后仍繼續(xù)死亡，這可能是由于農(nóng)藥在幼蟹體內(nèi)富集或轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的代謝產(chǎn)物導(dǎo)致。因此，低濃度苯噻酰草胺不會(huì)造成中華絨螯蟹幼蟹大規(guī)模迅速死亡，但長(zhǎng)期低劑量暴露可造成不可逆損傷，甚至死亡。

3.2 苯噻酰草胺脅迫對(duì)中華絨螯蟹幼蟹相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

本研究中，苯噻酰草胺脅迫下，中華絨螯蟹幼蟹鰓組織中的SOD活力、CAT活力隨著暴露時(shí)間和濃度的增加，均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，且達(dá)到峰值的時(shí)間具有同步性；肝胰腺組織中的SOD、CAT活力變化趨勢(shì)與鰓相似，也表現(xiàn)為隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)先增加后降低。然而，中華絨螯蟹幼蟹鰓中SOD、CAT活力誘導(dǎo)作用明顯早于肝胰腺，這可能是因?yàn)轹w組織能夠直接吸收水環(huán)境中的污染物，對(duì)苯噻酰草胺暴露更敏感，這一研究結(jié)果與苯并[a]芘對(duì)三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的毒性研究結(jié)果相似[32]。本研究結(jié)果表明，低濃度苯噻酰草胺的脅迫能夠在短期內(nèi)促進(jìn)中華絨螯蟹幼蟹的防御能力，這是由于當(dāng)外源污染物進(jìn)入到受試生物體內(nèi)，導(dǎo)致自由基大量形成，促使體內(nèi)SOD、CAT活力增加進(jìn)而加快自由基的清除[33]；而高濃度苯噻酰草胺或長(zhǎng)時(shí)間脅迫下，自由基形成過(guò)量且超出生物體可清除的范圍時(shí)，SOD、CAT活力受到抑制[34]，這可能是SOD和CAT活力先升后降的原因。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物之一，也是反映細(xì)胞氧化損傷的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果表明，苯噻酰草胺脅迫下，MDA在肝臟中的誘導(dǎo)水平顯著高于鰓組織，說(shuō)明幼蟹肝胰腺組織受到的脂質(zhì)過(guò)氧化作用遠(yuǎn)高于鰓組織。蔣閏蘭等[35]研究也發(fā)現(xiàn)，不同菲濃度處理中華絨螯蟹機(jī)體受氧化損傷程度存在組織差異，其中肝胰腺受損傷的程度較鰓組織嚴(yán)重。分析機(jī)體受氧化損傷程度出現(xiàn)組織差異的原因與組織在機(jī)體內(nèi)的功能不同有關(guān)，鰓組織主要功能是進(jìn)行氣體交換，而肝胰腺是有毒物質(zhì)的主要代謝場(chǎng)所。作為有機(jī)污染物，苯噻酰草胺具有親脂性，肝胰腺中脂肪含量較高有利于苯噻酰草胺蓄積。在不同苯噻酰草胺濃度脅迫下，MDA含量存在顯著性差異，表明生物體受氧化損傷程度與苯噻酰草胺濃度密切相關(guān)，在菲對(duì)中華絨螯蟹毒性效應(yīng)的研究也證實(shí)了這一結(jié)論[35]。肝胰腺中MDA含量變化規(guī)律與鰓中不同，其與苯噻酰草胺濃度間關(guān)系更為密切，且與鰓相比，肝胰腺中MDA含量對(duì)苯噻酰草胺濃度變化有更高的敏感性。本實(shí)驗(yàn)中，肝胰腺中MDA含量與較高濃度苯噻酰草胺間有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

4 結(jié)論

苯噻酰草胺對(duì)中華絨螯蟹幼蟹毒性等級(jí)為高毒，24、48、72、96 h LC50分別為5.31、2.11、0.47和0.18 mg/L，安全濃度為0.018 mg/L。低濃度苯噻酰草胺不會(huì)造成受試生物大規(guī)模迅速死亡，但長(zhǎng)期低劑量暴露可造成不可逆損傷。在較高濃度苯噻酰草胺脅迫下，中華絨螯蟹幼蟹引起肝胰腺和鰓組織的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷；在0.018 mg/L濃度苯噻酰草胺脅下，能夠通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化酶CAT和SOD活力升高來(lái)降低苯噻酰草胺脅迫危害。