宋亞寧，胡超瓊，王 沖，陳祥貴，2，黃玉坤，2*

（1 西華大學食品與生物工程學院 成都 610039 2 宜賓西華大學研究院 食品非熱加工重點實驗室 食品非熱加工工程技術研究中心 四川宜賓 644004）

氟喹諾酮類藥物 （Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）屬于第3 代喹諾酮類藥物，是一類由人工合成的廣譜殺菌藥，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有廣泛的抗菌活性[1]。喹諾酮類藥物母核結構如圖1所示，其中R1通常為堿性氮雜環(huán)，其可以提高抗菌活性，改善藥代動力學特征。R2和R3基團可以控制藥物體內的抗菌活性，擴大抗菌范圍。相較于第1 和第2 代喹諾酮類藥物，第3 代的喹諾酮類藥物對細胞膜的通透性更強，與細菌的結合能力更高，抗菌譜與抗菌活性也優(yōu)于前兩代。FQs 目前常被用于畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖中動物疾病的預防和治療，然而，F(xiàn)Qs 過量或不規(guī)范使用會造成抗生素獸藥殘留[2]，通常以環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、達氟沙星（Danofloxacin，DAN）等為主。此類獸藥殘留可能會導致生物蓄積性毒性[3]，包括耐藥細菌的產(chǎn)生，或耐藥菌株通過食物鏈和環(huán)境污染從動物轉移到人類，進而引起頭暈、耳鳴、頭昏、失眠、惡心、嘔吐、胸悶、心悸、心慌、血壓升高等不良反應[4]。中國、美國、歐盟和日本等國家都制定了FQs相關的最高殘留限量 （Maximum residue limits，MRLs），我國及美國均規(guī)定，牛、羊的脂肪與肌肉、奶、腎、肝中的 MRLs 分別為100，100，200 μg/kg和300 μg/kg，豬、兔與家禽等其它動物的脂肪與肌肉、肝、腎中的MRLs 分別為100，200 μg/kg 和300 μg/kg[5-6]。在2015年我國農(nóng)業(yè)部制定的2292號公告中[7]，明確規(guī)定在食品動物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4 種獸藥。除此之外，國外也明令禁止包括FQs 的幾種獸藥的使用[7]。建立靈敏、有效的痕量FQs 檢測方法是確保消費者健康的重要保障。

圖1 喹諾酮類藥物母核結構Fig.1 The mother nucleus structure of quinolones

目前，國內外建立了多種檢測FQs 的方法，主要有微生物法、超高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法、免疫分析法等[8]，這些方法往往因特異性弱、前處理復雜、儀器昂貴、耗時長等原因而不能大量應用于現(xiàn)場快速檢測的實際操作中[2，9]。目前，在快速檢測技術中利用抗體檢測FQs 是較為常見的方法。隨著適配體研究的不斷深入，基于核酸適配體的FQs 檢測方法具有顯著優(yōu)勢，主要表現(xiàn)為體外易于合成，目標范圍廣，親和力強，特異性較高以及受環(huán)境溫度影響較小等方面。該技術在FQs 快速檢測領域的應用具有較大的發(fā)展?jié)摿10]?；诖耍疚闹饕攀鰢鴥韧饣诤怂徇m配體傳感器檢測FQs 分析方法的研究進展，闡述了比色法、電化學法、熒光法等各類生物傳感器檢測方法的原理、技術應用及優(yōu)缺點，討論現(xiàn)有檢測方法存在的問題和未來檢測技術的發(fā)展方向。

1 核酸適配體

核酸適配體（Aptamer，Apt）是一種通過體外配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從人工構建的寡核苷酸文庫中篩選出來的一段對靶標物質有高親和力，并能夠特異性識別的單鏈寡核苷酸序列[11]。Apt 可以特定的二維或三維構象結合靶標物質，包括莖環(huán)、發(fā)夾、G-四鏈體等結構，以此實現(xiàn)目標物質的檢測[12]。Apt 的獨特優(yōu)勢在于①Apt 對靶標物質的特異性強，親和力高，Apt 與目標分子間的解離常數(shù)一般為10-9～10-12mol/L[13]。②Apt 目標范圍廣，核酸適配體不僅可與酶、抗體等分子結合，而且也可與金屬離子、生物毒素、藥物等小分子結合[14]。③Apt 體外可大量并迅速地化學合成，且易被官能團修飾。④Apt 分子質量小，一般由25～100 個堿基組成的單鏈寡核苷酸片段，同時與靶標物質結合時形成的空間位阻小[4]。⑤Apt 的穩(wěn)定性與可復性好，可反復變性復性[14]。由此，借助核酸適配體所具有的優(yōu)勢使得其在分析化學、醫(yī)學領域以及環(huán)境監(jiān)測和食品安全控制方面有廣泛的應用[15]。

2 基于核酸適配體生物傳感器的FQs 檢測方法

近年來基于核酸適配體技術的FQs 檢測方法得到快速的發(fā)展，主要包括熒光法、比色法、電化學法等。由表1知，大多數(shù)研究者選用檢測OFL的主要Apt 序列為Reinemann 等[16]篩選的序列，表明所篩選的序列與OFL 的親和力較強，適用于檢測食品中OFL 的殘留量。同時，表1也表明檢測FQs 目前研究最廣泛的是熒光法，并利用此法測定水樣中ENR 的含量，檢測限可低至0.04 ng/mL。另外，除表1篩選出的能特異性結合FQs 中的特定抗生素的核酸適配體序列外，Mehlhorn 等[9]和Han 等[17]篩選出與DAN 具有高親和力的RNA適配體序列，即5'-UCAGGCUCCUGUGAAGCAACCGAAUGGACUGAA-3'，目前還沒有建立相應的檢測方法。由此可看出，目前適用于FQs 檢測的Apt 序列報道較少，并且基于核酸適配體生物傳感器檢測FQs 的方法僅局限于比色法、熒光法和電化學法3 大類。另外，基于Apt 識別的FQs 分析方法建立過程中，較多研究者還利用不同的納米材料修飾Apt，增加其與FQs 結合的穩(wěn)定性，如上轉換納米顆粒 （Upconversion nanoparticles，UCNPs）[18]、氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）[19]、金納米粒子（Gold nanoparticles AuNPs）[20-21]、碳納米管-V2O2殼聚糖納米復合材料 （Carbon nanotube-V2O2-chitosan nanocomposites，CNT-V2O2-CS）[22]等，以此進一步提高檢測的靈敏度和精確度。隨著核酸適配體技術的發(fā)展，核酸適配體生物傳感器的檢測方向將定位于高通量和現(xiàn)場實時快速檢測。

考參獻文[23][24][16][25][22][26][28][30][16][31][32][33][35]圍范性線及提未及提未72.2～144.4 ng/L 18～7 227 ng/mL 0.5～8.0 ng /mL及提未0.01～2 000 pg/mL及提未35.9～251.6 μg/L及提未1.8～89.7 ng/L 7.2～108.3 ng/L 0.4～72.2 ng/L括概獻文的法方測檢FQs的器感傳物生體配適酸核于基1表The literature on FQs detection method based on aptamer biosensor is briefly summarized Table 1 限測檢略策測檢’’-3 5列序體配適本樣測檢l5 ng/mL AuNPs’-CCCATCAGGGGGCTAGGCTAACACGGTTCGGCTCTCTGAGCCCGGGTTA 5及提未’TTTCGGGGGA-3 0.5 μg/L AuNPs’-ATACCAGCTTAITCAATTGCAGGGTATCTGAGGCTTGATCTACTAAATGTC 5奶牛清血[16]’GTGGGGCAITGCTAITGGCGTTGATACGTACAATCGTAATCAGTTAG-3 1.2 ng/L AuNPs’-ATACCAGCTTATTCAATTAGTTGTGTATTGAGGTTTGATCTAGGCATAGT液 5、尿水來自’CAACAGAGCACGATCGATCTGGCTTGTTCTACAATCGTAATCAGTTAG-3 0.361ng/mL AuNPs 水 5’-ATACCAGCTTATTCAATTAGTTGTGTATTGAGGTTTGATCTAGGCATAGTC、污水來自[16]AACAGAGCACGATCGATCTGGCTTGTTCTACAATCGTAATCAGTTAG-3’0.5 ng/mL CNT-V2O5-CS’-ATACCAGCTTATTCAATTGCAGGGTATCTGAGGCTTGATCTACTAAATGTC 5奶牛[16]’GTGGGGCATTGCTATTGGCGTTGATACGTACAATCGTAATCAGTTAG-3 87 ng/L合結DNA鏈單’-ATACCAGCTTATTCAATTGCAGGGTATCTGAGGCTTGATCTACTAAATGTC 5、清、血奶牛白蛋[ 16 ]’GTGGGGCATTGCTATTGGCGTTGATACGTACAATCGTAATCAGTTAG-3樣水6.07 fg/mL聚三和醛甲苯四芘’-CCCATCAGGGGGCTAGGCTAACAGGTTCGGCTCTCTGAGCCCGGGTTAT 5清血共的成形合聚胺氰[27]’TTCAGGGGGA-3架骨機有價0.06 ng/mL Fe3O4UCNPs 5’-CCCATCAGGGGGCTAGGCTAACACGGTTCGGCTCTCTGAGCCCGGGTTAT、魚、黑魚鱸[29]’TTCAGGGGGA-3魚、鯖魚鯰26.9 g/L代取爭競[16]’’-GAAACGAGGTGCTTGACGG-TACGATGTTATACCGGGTTAC-3 5樣水0.04 ng/mL UCNPs’-CCCATCAGGGGGCTAGGCTAACACGGTTCGGCTCTCTGAGCCCGGGTTAT 5、魚、鯰魚鱸’TCAGGGGGA-3魚鯖1.3 ng/L GO’-GCTGTGTGACTCCTGCAAGTCCGACATACCTTAGTGCCCTGATATAATGT 5奶牛[32]’AACACTATGAGCAGCTGTATCTTGTCTCC-3 0.6 ng/L B 明丹AuNPs 羅5’-ATACCAGCTTATTCAATTAGTTGTGTATTGAGGTTTGATCTAGGCATAGT奶牛[16]’CAACAGAGCACGATCGATCTGGCTTGTTCTACAATCGTAATCAGTTAG-3 0.12 ng/L SYBR Green I’-ATACCAGCTTATTCAATTAGTTGTGTATTGAGGTTTGATCTAGGCATAGT 5液尿水江[34]’CAACAGAGCACGATCGATCTGGCTTGTTCTACAATCGTAATCAGTTAG-3靶標物ENR CIP OFL OFL CIP ENR ENR OFL法方測檢法色比法學化電法光熒

2.1 熒光法

熒光法檢測是基于某些熒光物質在一定的激發(fā)波長下能夠發(fā)射熒光的原理，由檢測到的熒光強弱變化來進行定性、定量分析物質含量的一種方法[36]。熒光法具有高靈敏度、低背景值和良好選擇性的優(yōu)勢，在生命醫(yī)學、化學分析、環(huán)境監(jiān)測和食品安全控制等各檢測領域方面具有廣泛應用[37]。根據(jù)目前發(fā)表的文獻，構建基于核酸適配體生物傳感器結合熒光法的檢測方法應用廣泛。

Liu 等[30]采用UCNs 作為信號源和Apt 作為特定識別元件構建了檢測ENR 的熒光生物傳感器。其原理如圖2所示。首先，將SiO2修飾的氨基化Fe3O4以及氨基化的UCNPs 利用鏈霉親和素反應分別修飾Apt 和其互補鏈（Complementary DNA，cDNA），將修飾完成后的Apt 和cDNA 結合形成具有背景熒光信號的雙鏈結構，作為此傳感器的雜交探針 （用UCNPs-cDNA/Apt-Fe3O4表示雜交探針）。當ENR 存在時，ENR 優(yōu)先與Apt-Fe3O4特異性結合，使UCNPs-cDNA 和Apt-Fe3O4之間的部分雙鏈體結構解離，然后釋放雜交探針中的一些UCNPs-cDNA，從而使得熒光強度降低。最后進行磁分離，檢測雜交探針表面上未釋放的UCNPs的熒光強度，達到快速檢測ENR 的目的。此試驗的日內和日間回收率為85.1%～98.5%，相對標準偏差2.4%～5.0%和3.0%～4.3%范圍，LOD 為0.06 ng/mL，定量限為0.20 ng/mL。此傳感器的優(yōu)勢在于使用近紅外光觸發(fā)UCNPs 時，避免了來自樣品基質的熒光干擾，實現(xiàn)了高靈敏度檢測。同時，引入磁性納米顆粒簡化了分離過程，使檢測過程相對快捷。

圖2 用UCNPs 信號源構建核酸適配體生物傳感器檢測ENR 的原理圖[30]Fig.2 Using UCNPs signal source to construct aptamer-based biosensors detection[30]

此外，Liu 等[31]通過集成Apt 和分子印跡聚合物（Molecular imprinted polymers，MIPs）兩種抗生素識別元件，開發(fā)了一種熒光“雙識別”傳感器，用于檢測ENR。此方法原理如圖3所示。首先利用二氧化硅修飾UCNPs 并進一步氨基化，再通過生物素-親和素反應使ENR 的Apt 固定在UCNPs表面。當ENR 存在時，Apt 與ENR 特異性結合，此時完成分子生物親和識別。另外，引入分子印跡技術中常用的甲基丙烯酸單體，使其與未能結合Apt的ENR 相互作用，進行分子印跡識別。在聚合過程中，需先在UCNPs 表面固定ENR 適配體，后將ENR 與其Apt 特異性結合形成ENR-Apt 復合物，將復合物固定在聚合物基質上。最后洗滌除去ENR 模板，獲得“雙重識別”印跡腔，其在空間構象和功能上與ENR 互補，當ENR 存在時可與其重新結合。該試驗的回收率在87.05%～96.24%之間，相對標準偏差值在1.19%～4.83%范圍，LOD 為0.04 ng/mL，定量限為0.12 ng/mL。此研究的創(chuàng)新之處在于將化學修飾的Apt 引入分子印跡聚合物中，構建具有雙重識別效應的核酸適配體生物傳感器，且開發(fā)的傳感系統(tǒng)可用于分析不同的魚樣品，回收率良好，可定量檢測ENR。

圖3 熒光“雙識別”傳感器檢測ENR 的原理圖[31]Fig.3 Principle diagram of detection of ENR by fluorescence‘double recognition’ sensor[31]

Zhang 等[38]基于ENR 熒光、Apt 和GO，設計了非熒光標記法測定原料乳中ENR 的殘留量。此方法的原理是ENR 自身具有熒光，未加入ENR 的Apt 時，ENR 可以π-π 堆積作用吸附在GO 上，使其熒光淬滅，熒光強度降低。當加入ENR 的Apt時，Apt 可與ENR 結合改變其三維結構，使ENR遠離氧化石墨烯表面，熒光恢復，熒光強度增加。此結果表明，ENR 的LOD 為1.3 ng/L，回收率94.1%～108.5%。此方法的優(yōu)勢在于ENR 自身具有熒光，不需標記，減少背景熒光信號，且Apt 與GO相結合，為構建一種快速、靈敏和經(jīng)濟的ENR 檢測生物傳感器提供了前景。

Yan 等[33]利用非標記OFL 的Apt、AuNPs 和羅丹明B（Rhodamine B，RB）構建檢測OFL 的熒光生物傳感器，其原理如圖4所示。當OFL 不存在時，AuNPs 被OFL 適配體包覆，在高濃度NaCl 溶液中仍保持分散狀態(tài)，此時，AuNPs 的分散發(fā)射能有效降低RB 的熒光強度。OFL 存在時，OFL 與適配體結合形成穩(wěn)定化合物，使AuNPs 脫離Apt，從而形成聚集狀態(tài)，此時，聚合的AuNPs 無法猝滅RB 的熒光強度。由此，通過區(qū)分熒光強度的大小，就可以定量牛奶和水樣品中OFL 的濃度。此試驗中檢測水樣品線性范圍為7.2～108.3 ng/L，LOD 為0.6 ng/L；檢測牛奶樣品線性范圍為7.2～108.3 ng/L，LOD 為1.7 ng/L。此方法具有工藝簡單、儀器價格低廉、測量時間短等優(yōu)點。

圖4 利用AUNPs 和RB 構建核酸生物傳感器檢測OFL[33]Fig.4 Aptamer-based biosensors construction using AUNPs and RB to detect OFL[33]

此外，Yi 等[35]利用染料SYBR Green I 與Apt構建熒光傳感器測定OFL，其原理如圖5所示。當OFL 不存在時，SYBR Green I 可嵌入OFL 適配體的G-四鏈體結構，使SYBR Green I 的熒光強度增強。當OFL 存在時，OFL 與其Apt 特異性結合，破壞序列G-四鏈體結構，使SYBR Green I釋放到溶液中，SYBR Green I 熒光強度減弱。此試驗的LOD 為0.12 ng/L，線性范圍0.4～72.2 ng/L，在自來水、河水和尿液中的回收率為91.3～119.0%，相對標準偏差小于11.6%。此方法的優(yōu)勢是對類似物、Hormon、殺蟲劑等多種干擾有較好的選擇性，是一種靈敏度高，選擇性好，操作步驟少簡單，檢測時間短，試劑成本低的測量方法。此方法存在缺陷，在檢測實際樣品中較低濃度的OFL 時，方法的穩(wěn)定性和精確度未達到測定要求，因此需提高低濃度OFL 的檢測效果，以達到在環(huán)境中可以穩(wěn)定實時精確檢測的效果。

圖5 利用SYBR Green I 構建核酸生物傳感器檢測OFL[35]Fig.5 Using SYBR Green I to construct an aptamer-based biosensor to detect OFL[35]

目前，熒光生物傳感器較其它傳感器研究得較多，目前大多研究ENR 和OFL 的檢測，而對FQs 的其它類別研究較少。雖然熒光生物傳感器具有高靈敏度、低背景值和良好選擇性的優(yōu)勢，但是目標物質低濃度檢測和實際樣品的檢測中仍然存在重現(xiàn)性、精確度和靈敏度都較低的缺陷。需進一步優(yōu)化熒光生物傳感器，使其在食品安全的實時檢測中得到高效的運用。

2.2 比色法

納米金、納米銀等納米材料的表觀顏色在納米微粒的表面性質發(fā)生改變后產(chǎn)生相應的變化，以此為基礎通過顏色對比建立起來的方法稱為納米比色法[39]。其中，納米金比色傳感器的原理是基于靶標物質未與Apt 結合時AuNPs 呈分散狀態(tài)，溶液呈紅色，靶標物質與Apt 結合后導致Apt 構象發(fā)生變化，使得Apt 不再吸附在AuNPs 表面，在高鹽溶液中呈聚集狀態(tài)，溶液由紅色變?yōu)樗{色，以此來實現(xiàn)靶標物質含量的檢測[40]。另外，AuNPs 對單雙鏈DNA 的吸附狀態(tài)不同，單鏈DNA 對AuNPs 具有保護作用，即分散狀態(tài)的AuNPs 在單鏈DNA 存在時溶液仍呈紅色，而雙鏈DNA 不具有此性質。根據(jù)這些性質建立了多種檢測FQs 的方法。該方法的響應速度快、操作簡便、成本低廉、靈敏度和精密度高，是目前具有實現(xiàn)現(xiàn)場可視化快速檢測發(fā)展?jié)摿Φ姆椒?。目前基于核酸適配體技術和比色法結合檢測氟喹諾酮類藥物殘留的方法較少，該類型生物傳感器應盡快研究開發(fā)。

2017年，Lavee 等[24]基于Apt、改性的具有花狀結構的AuNPs 及其表面可催化還原4-硝基苯酚溶液從黃色變?yōu)闊o色，首次開發(fā)了一種基于Apt比色法測定CIP 的方法。其原理如圖6所示。AuNPs 修飾兩條單鏈DNA，并通過兩條單鏈DNA的部分序列互補連接CIP 的Apt，形成花狀的包覆層。未加入CIP 時，AuNPs 上的花狀包覆層可以防止其還原4-硝基苯酚，使溶液保持黃色。當加入CIP 時，Apt 與CIP 特異性結合后游離到溶液中，AuNPs 發(fā)揮其催化活性，使溶液從黃色變?yōu)闊o色，由此通過顏色的轉變來檢測目標物質CIP。該方法的LOD 為0.5 μg/L，被成功應用于加標水、血清和牛奶中CIP 含量的檢測。該方法優(yōu)勢是可以直接通過肉眼觀察到顏色變化而無需采用儀器檢測，更有利于實現(xiàn)野外樣品的原位和實時檢測。

圖6 比色傳感器用于檢測CIP 原理圖[24]Fig.6 Schematic diagram of colorimetric sensor for CIP detection[24]

2018年Zhou 等[41]提出了一種基于Apt 和AuNPs 結合的比色法測定水溶液中OFL 的方法。該法原理如圖7所示，在沒有靶標物質OFL 時，AuNPs 被Apt 包裹，在高NaCl 濃度下保持分散狀態(tài)而呈紅色，于波長520 nm 處有吸收峰。當靶標物質OFL 存在時，OFL 與Apt 特異性結合，使得AuNPs 不與Apt 結合而暴露于鹽溶液中，溶液由紅色逐漸變?yōu)樗{色，在波長650 nm 處有新的吸收峰，由此可根據(jù)吸光度的變化來達到檢測OFL 的目的。該試驗的線性范圍為72.2～144.4 ng/L，LOD為1.2 ng/L，具有較高的特異性，操作簡便，價格低廉，可通過顏色和吸光度靈敏的變化測定。在水環(huán)境中檢測環(huán)境和生物樣品中殘留的OFL，該法具有應用潛力，但仍存在局限性，即在土壤環(huán)境和固相環(huán)境中的應用還有待優(yōu)化。另外，與實際的復雜組分樣品測定相比仍存在一定的差距，有必要開發(fā)改進系統(tǒng)，以便對OFL 進行更穩(wěn)定、更具體和更敏感的檢測。

圖7 基于AuNPs 建立比色傳感器檢測OFL[41]Fig.7 Set up colorimetric sensors to detect OFL based on AuNPs[41]

比色生物傳感器一般偏向運用AuNPs 比色探針檢測FQs，具有較好的響應速度、靈敏度和精密度，是目前最具發(fā)展為現(xiàn)場快速檢測適用的傳感器分析方法潛力。然而，在實際檢測復雜組分樣品時并未達到實驗室檢測水平，需進一步優(yōu)化檢測系統(tǒng)，使其能夠檢測多樣環(huán)境中的FQs 殘留。

2.3 電化學法

電化學法檢測目標物具有特異性高、分析速度快及成本合理等優(yōu)點[42]。該方法的原理是將靶標物質的Apt 修飾到電極表面，當加入靶標物質時，Apt 與其發(fā)生特異性結合，使核酸適配體空間構象發(fā)生改變，以此通過電流、電壓、電阻強弱的變化進行信號的表達。核酸適配體電化學傳感器的優(yōu)勢主要源于酶、金屬納米粒子和氧化還原化合物等具有電子轉移活性物質可共價標記適配體，無需標記目標物質就可測定。目前該方法的缺陷是如何確保適配體能充分穩(wěn)定以及完全覆蓋電極表面，并保持與未覆蓋電極時識別靶標物質的親和力不降。

Pilehvar 等[25]首次建立了一種基于在AuNPs上固定Apt 的高效、穩(wěn)定和靈敏測定OFL 的非標記電化學傳感器，其原理如圖8所示。在OFL 缺失時，單鏈DNA 適配體修飾的電極產(chǎn)生極低的背景伏安信號，而OFL 存在時，單鏈DNA 適配體與其結合導致適配體構象發(fā)生改變，使OFL 分子靠近電極表面，與傳感器表面之間實現(xiàn)高效的電子轉移過程。試驗結果表明LOD 為1×10-9mol/L。利用固定適配體使該法得到顯著優(yōu)化，能有效代替常見固定目標分子的檢測方法，檢測限低，操作程序簡單，穩(wěn)定性和選擇性高，并能應用于實際環(huán)境。

圖8 非標記電化學法檢測OFL 原理圖[25]Fig.8 Schematic diagram of the unmarked electrochemical method for the detection of OFL[25]

Abnous 等[26]基于金電極和單鏈DNA 結合蛋白 （Single-stranded DNA-binding protein，SSB）的特性構建了檢測CIP 的電化學傳感器。SSB 的特性包括對單鏈DNA 的高選擇性，大尺寸及其在pH 7.4 時帶負電荷。該傳感器原理是CIP 不存在時，SSB 可作為單鏈DNA 與Apt 結合，此時SSB的表面尺寸很大，電極產(chǎn)生空間位阻，并排斥帶負電荷的氧化還原探針，使得氧化還原探針對金電極表面的接觸較少，產(chǎn)生微弱的電化學信號。CIP存在時，Apt 與其特異性識別形成共軛物，導致Apt 構象發(fā)生改變，不能與SSB 結合，此時，位阻和排斥靜電力非常低，氧化還原探針進入電極表面并增強電化學信號。試驗表明CIP 的LOD 低至87 ng/L。另外，該法已成功用于血清、牛奶和水樣品中環(huán)丙沙星的測定。

除此之外，Wang 等[28]基于芘四苯甲醛與三聚氰胺聚合形成的共價有機骨架固定適配體，建立了非標記電化學傳感器法檢測ENR，達到高效、靈敏、穩(wěn)定檢測ENR 的目的，結果表明電化學適配體重復性好，穩(wěn)定性好，適用于人血清樣品。然而，由于共價多孔骨架很難實現(xiàn)有規(guī)律的納米化，因此形成工作電極涂層不均勻，導實際應用中傳感性能下降，需進一步改進。

電化學生物傳感器中最為廣泛研究的是非標記型，因其具有便攜性、操作簡單、成本低、分析速度快的優(yōu)點而得到快速發(fā)展。然而，電化學生物傳感器的組裝過程相對較為復雜，且前期的適配體與電極的組裝通常耗費大量時間，需開發(fā)趨向于集成裝置的便攜式電化學生物傳感器系統(tǒng)，進一步提高檢測的高效性和實用性。

2.4 其它方法

除以上幾種常見方法外，趙秋伶等[12]基于核酸適配體的酶聯(lián)分析法研制了ENR 的酶聯(lián)適配體分析檢測試劑盒。如圖9所示。該方法的原理是A1 標記生物素并與酶板固定的鏈霉親和素相連接，適配體B1 標記了異硫菁酸熒光素（Fluoresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC），兩者互補雜交被固定到含有鏈和親霉素的酶板上，此時加入底物ENR，使得底物與適配體A1 特異性結合，迫使與A1 部分雜交的標記了熒光素的B1 適配體脫離其酶板1。然后，取出B1 加入固定C1 的酶板2。B1、C1 互補雜交形成雙鏈，CI 捕獲B1。FITC 能捕獲帶辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標簽的FITC 抗體。HRP 能催化四甲基聯(lián)苯胺底物顯藍色，加入酸后藍色產(chǎn)物轉變?yōu)辄S色。該方法的優(yōu)勢在于試劑盒穩(wěn)定性良好，抵抗反復凍融至少60 次。在-20 ℃環(huán)境中可保存3年以上，在4 ℃環(huán)境中可保存6 個月以上。此外，還有快速、方便高效和準確度高等優(yōu)點。

圖9 競爭取代酶聯(lián)免疫檢測ENR 原理[12]Fig.9 Schematic diagram of competitive enzyme-linked immunosorbent assay for ENR[12]

3 結論與展望

核酸適配體易被官能團修飾作為標記或固定，與金屬納米粒子、磁性納米材料、上轉換納米材料、熒光染料以及量子點等通過π-π 堆積作用或共價結合等方式用于靶標物質的檢測[36]。雖然目前核酸適配體相對于抗體具有諸多優(yōu)勢，但是基于核酸適配體檢測FQs 的技術還處于探索階段，存在許多缺陷。主要包括：①核酸適配體的篩選易產(chǎn)生非特異性的片段且篩選過程繁雜、操作復雜；②篩選成功的核酸適配體不能同時大量檢測同類型靶標物質，實用性較差；③FQs 核酸適配體序列比較有限，生物識別機理不明確，序列改造缺少科學依據(jù)；④相較于抗體所構建的檢測體系來說，商業(yè)性較差。目前，許多研究者主要集中于研究以下內容：①提高檢測效率，引入生化檢測信號放大、多靶標共同識別功能的同時，盡量簡化操作步驟；②有效優(yōu)化適配體序列，以提升其穩(wěn)定性、識別性，易保存，在檢測應用時性能穩(wěn)定；③集成適配體探針的便攜式裝置設計，以及探針的再生和重復使用性能的改善；④優(yōu)化檢測的重復性、靈敏度和選擇性?？傊S著核酸適配體研究的深入，與現(xiàn)代分析技術的融合、創(chuàng)新，基于核酸適配體的檢測技術將向簡便化、高精度、高靈敏度、高穩(wěn)定性、高通量、極速實時檢測的方向發(fā)展。特別是針對基層監(jiān)測的實際需求，便攜式、高通量和廉價檢測系統(tǒng)的開發(fā)是未來核酸適配體發(fā)展的主流趨勢。