Hippo信號(hào)通路中MST1和MST2的表達(dá)在肝癌干細(xì)胞干性維持和自我更新中的意義

閭少冬 魏勇鵬 王卓 袁建勇 盧軍華

肝細(xì)胞癌是目前全球第六大常見的惡性腫瘤，預(yù)后總體較差，并且患者的生存率在很大程度上是由肝細(xì)胞癌的分期決定的[1]。目前肝細(xì)胞癌治療后復(fù)發(fā)率仍較高[2-3]。因此對(duì)肝細(xì)胞癌的形成和發(fā)生的深入研究，對(duì)于肝細(xì)胞癌的發(fā)現(xiàn)和早期篩查，提高肝細(xì)胞癌的治愈率，降低肝細(xì)胞癌的病死率，就顯得尤為重要。

Hippo信號(hào)通路，不論是在果蠅這類的模式生物中，還是在高等的哺乳動(dòng)物中，都是高度保守的。它的功能主要涉及控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡、分化和器官大小等[4]。Hippo信號(hào)通路通過上游調(diào)節(jié)蛋白接收來自細(xì)胞外的生長(zhǎng)抑制信號(hào)，然后將信息轉(zhuǎn)移到主要核心激酶，最后轉(zhuǎn)移到下游效應(yīng)器[5]。最近的大量研究證實(shí)了Hippo信號(hào)在癌癥發(fā)生中的作用。Hippo通路實(shí)際上是一種腫瘤抑制通路，功能異常的Hippo信號(hào)通路參與了多種生物學(xué)過程[6]。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

(一)實(shí)驗(yàn)組織材料 本研究從東方肝膽外科醫(yī)院肝外五科收集了32例肝癌組織樣本和30例正常肝組織樣本。根據(jù)肝癌AFP水平分類，32例肝癌患者中AFP水平<25.0 μg/mL的占3例，AFP水平在25.0～200.0 μg/mL的占16例，AFP水平>200.0 μg/mL的占13例；30例肝良性增生患者中AFP水平<25.0 μg/mL的占11例，AFP水平在25.0～200.0 μg/mL的占11例，AFP水平>200.0 μg/mL的占8例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有納入個(gè)體均簽署書面知情同意書。

(二)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞材料 本研究中使用的L-02細(xì)胞、Huh7細(xì)胞、SK-Hep1細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，SMMC-7721細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。L-02細(xì)胞、SK-Hep1細(xì)胞和HepG2細(xì)胞培養(yǎng)使用的MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，Huh7細(xì)胞培養(yǎng)使用的DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone，SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)使用的RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco。培養(yǎng)基中均需加入10%胎牛血清，胎牛血清購(gòu)自Excell。所有細(xì)胞均置于37 ℃含有5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。

二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染實(shí)際脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen，操作方法參照Invitrogen的產(chǎn)品說明。消化細(xì)胞并鋪到12孔板中，待細(xì)胞完全貼壁且達(dá)到約60%匯合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。MST1和MST2的shRNA均由Tsingke公司設(shè)計(jì)并合成。

三、主要分子和化學(xué)試劑

RNA抽提所用的RNAiso試劑購(gòu)自Takara；酚氯仿異戊醇、異丙醇等化學(xué)試劑購(gòu)自申試；RNase free water購(gòu)自Takara；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promrga；Oligo dT18購(gòu)自Takara；SYBR Green熒光定量試劑盒均購(gòu)自Bio-rad。Western blot實(shí)驗(yàn)所用的RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自Beyotine；SDS-PAGE預(yù)制膠和蛋白電泳相關(guān)試劑均購(gòu)自雅酶；脫脂奶粉購(gòu)自BD；PVDF膜購(gòu)自GE healthcare；ECL顯色液購(gòu)自Millipore。

四、qRT-PCR

使用RNAiso裂解細(xì)胞至無RNA酶的1.5 mL EP管中，參照RNAiso的產(chǎn)品說明書提取肝癌組織或肝癌細(xì)胞中的總RNA。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和程序參照Promega公司的產(chǎn)品說明書。使用RNase free water將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋10倍，并作為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)使用Bio-rad公司的SYBR Green熒光定量試劑盒，具體的反應(yīng)體系和程序參照Bio-rad公司的產(chǎn)品說明書。qRT-PCR反應(yīng)所用引物見表1。

表1 本研究所用引物序列

五、Western blot

使用RIPA裂解液收集細(xì)胞至1.5 mL的EP管，通過BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白的濃度，向細(xì)胞裂解液中加入蛋白loading buffer煮沸5 min后，按每孔10 μL的比例上樣到10% SDS-PAGE膠中，使用80 V電壓，電泳1 h至蛋白樣品徹底分層。隨后在280 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜。將膜轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉中封閉1 h，分別加入TBST稀釋的一抗，稀釋比例和孵育時(shí)間參照各個(gè)一抗的產(chǎn)品說明，使用TBST充分洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL顯色液顯影。應(yīng)用凝膠圖像分析軟件Image J分析各條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)中所用抗體MST1(A0109)、MST2(A9036)、GAPDH(A19056)、AMPK(A12718)、p-AMPK(AP0116)、OCT-4(A7920)、Nanog(A14150)以及對(duì)應(yīng)的兔二抗(AS014)和鼠二抗(AS003)均購(gòu)自愛博泰克。

六、免疫組織化學(xué)染色

將肝癌組織和正常的肝組織，于4%多聚甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟處理。微波加熱修復(fù)抗原，至沸騰后停止加熱5 min，然后重復(fù)加熱一次，冷卻至常溫。PBS沖洗切片后滴加正常山羊血清封閉液封閉。HistostainTMSP-9000免疫組化染色試劑盒(Zymed公司)染色。分別使用MST1和MST2一抗4 ℃處理過夜。復(fù)溫并用PBS沖洗后，滴加對(duì)應(yīng)的二抗，于37 ℃下30 min。PBS沖洗后滴加辣根標(biāo)記工作液孵育，DAB顯色5～10 min，鏡下調(diào)整染色時(shí)間，蘇木精復(fù)染1 min后樹膠封片，拷片后拍照保存。

七、流式細(xì)胞術(shù)

收集SMMC-7721細(xì)胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×106/mL，取1 mL細(xì)胞1 500 r/min離心10 min，棄上清，每毫升細(xì)胞加2 mL PBS，再離心，棄上清后，加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃過夜。第二天用PBS洗滌細(xì)胞2次，取100 μL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入0.5 mL含50 μg/mL RNAase PI溶液中，避光30 min后用100目的尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀分別記錄CD90+、CD105+和CD133+型細(xì)胞的分布情況。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(USA)進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組間比較為t檢驗(yàn)，多組間的比較應(yīng)采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MST1和MST2在肝癌中高表達(dá)

為了研究MST1和MST2在肝癌中的作用，筆者首先檢測(cè)了MST1和MST2在肝癌中的表達(dá)情況。我們從東方肝膽外科醫(yī)院肝外五科取32例肝癌組織樣本，以及30例正常的肝組織樣本，通過qRT-PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了MST1和MST2的表達(dá)情況。結(jié)果表明在肝癌組織中，MST1和MST2均顯著高表達(dá)(圖1A、圖1B)。通過qRT-PCR和Western blot在肝癌細(xì)胞系Huh7、SK-Hep1、HepG2和SMMC-7721中檢測(cè)MST1和MST2的表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果表明，對(duì)比人正常肝細(xì)胞L-02，MST1和MST2在Huh7、SK-Hep1、HepG2和SMMC-7721中的表達(dá)分別為：2.16±0.25、1.73±0.15、2.63±0.31、2.36±0.25；1.97±0.21、2.12±0.19、2.76±0.18、2.92±0.21。其中MST1和MST2的表達(dá)在HepG2和SMMC-7721肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)最高(圖1D)，因此使用HepG2和SMMC-7721細(xì)胞系作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究材料。以上結(jié)果表明，MST1和MST2在肝癌中高表達(dá)，提示MST1和MST2與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。

二、SMMC-7721中肝癌干細(xì)胞的鑒定

為了研究MST1和MST2在肝癌干細(xì)胞自我更新過程中的作用。本研究首先通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90、CD105、CD133，發(fā)現(xiàn)CD90+、CD105+、CD133+型的細(xì)胞在SMMC-7721細(xì)胞中占有一定比例(圖2A)，筆者從中分選出CD90+、CD105+、CD133+的SMMC-7721細(xì)胞作為肝癌干細(xì)胞模型進(jìn)行后續(xù)研究。經(jīng)過分選的SMMC-7721肝癌干細(xì)胞，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)其形成微球體的能力顯著增強(qiáng)(圖2A)。在SMMC-7721肝癌干細(xì)胞中，檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)蛋白AMPK、OCT-4和Nanog的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，相比普通肝癌細(xì)胞HepG2，AMPK在肝癌干細(xì)胞SMMC-7721中的表達(dá)情況無明顯變化，而OCT-4和Nanog的表達(dá)分別為2.56±0.21、2.32±0.11，提示OCT-4和Nanog在肝癌干細(xì)胞中顯著上調(diào)。Western blot結(jié)果顯示，在肝癌干細(xì)胞中AMPK的磷酸化水平顯著增加，OCT-4和Nanog的表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)與qRT-PCR結(jié)果一致(圖2B)。以上結(jié)果表明，通過檢測(cè)干細(xì)胞微球體的形成以及干細(xì)胞標(biāo)志物AMPK、OCT-4和Nanog的表達(dá)，本研究成功誘導(dǎo)了SMMC-7721肝癌干細(xì)胞。

圖1 MST1和MST2在肝癌中高表達(dá)A：qRT-PCR檢測(cè)肝癌組織中MST1和MST2的表達(dá)，*表示與Normal組相比P<0.05；B：免疫組化檢測(cè)肝癌組織中MST1和MST2的表達(dá)；C：Western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞中MST1和MST2的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次

三、MST1和MST2促進(jìn)了肝癌干細(xì)胞的干性維持

為了研究MST2和MST2對(duì)肝癌干細(xì)胞自我更新的影響，筆者分別設(shè)計(jì)并合成了MST1和MST2的shRNA，通過Western blot檢測(cè)shRNA的敲低效率。結(jié)果顯示三對(duì)shRNA均能成功敲低MST1(圖3A)和MST2的表達(dá)(圖3B)。在SMMC-7721肝癌干細(xì)胞中，敲低MST1和MST2后，肝癌干細(xì)胞微球體顯著減少(圖3C)。通過qRT-PCR結(jié)果顯示，檢測(cè)了敲低MST1后，OCT-4和Nanog的表達(dá)下調(diào)為0.48±0.02和0.26±0.08；敲低MST2后，OCT-4和Nanog的表達(dá)下調(diào)為0.35±0.06和0.42±0.03。Western blot結(jié)果顯示，敲低MST1和MST2，AMPK的磷酸化水平顯著減弱，OCT-4和Nanog的下調(diào)趨勢(shì)與qRT-PCR結(jié)果一致(圖3D)。干細(xì)胞標(biāo)志物指標(biāo)表明，MST1和MST2的敲低抑制了肝癌干細(xì)胞的干性維持能力。

討 論

近年的研究表明，Hippo信號(hào)通路的活性被證實(shí)在多種腫瘤的發(fā)生過程中異常上調(diào)，例如在約17%的宮頸鱗狀細(xì)胞癌、約16%的鱗狀細(xì)胞癌、約15%的食管鱗狀細(xì)胞癌和約14%的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中觀察到Y(jié)AP1、Taz和Tead2的癌基因激活和擴(kuò)增[7]。當(dāng)然其中不乏在肝癌中的研究。過表達(dá)的YAP可以促進(jìn)肝臟生長(zhǎng)，由此也可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌的快速發(fā)展，表明Hippo信號(hào)通路是調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的重要因素[8]。更深入的研究表明，在晚期的肝細(xì)胞癌中通過siRNA-LNPs技術(shù)抑制YAP1的表達(dá)，有著很好的抑制腫瘤的效果[9]。在肝癌中，Hippo信號(hào)通路受到多種信號(hào)通路相互作用，與包括Wnt通路，Notch通路還有GPCRs通路在內(nèi)的多個(gè)通路共同調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在MST1和MST2缺陷的肝臟中，Notch調(diào)控了一個(gè)正反饋回路，從而增強(qiáng)YAP信號(hào)，并進(jìn)一步促進(jìn)肝癌的發(fā)生。YAP1也被證明可以促進(jìn)JAG1的表達(dá)上調(diào)，從而在肝癌細(xì)胞中激活Notch信號(hào)通路，這表明兩種通路之間存在相互作用[10]。而Wnt信號(hào)通路可以通過干擾Notch-YAP的反饋反應(yīng)，抑制肝癌細(xì)胞中YAP/TAZ信號(hào)[10-11]。

Wang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌中，MST1和MST2的過表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)YAP1的磷酸化，進(jìn)一步在mRNA水平上下調(diào)CTGF和AREG的表達(dá)。此外，轉(zhuǎn)錄因子CREB通過與YAP啟動(dòng)子的-608/-439位點(diǎn)結(jié)合促進(jìn)YAP1的表達(dá)[13]。MEK1-YAP1的相互作用被證明對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤發(fā)生很重要[14]。各種膜相關(guān)蛋白，如NF2/Merlin、WWC和Angiomotin家族的Scaffolding蛋白已被證明可調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路[15-16]。進(jìn)一步的研究表明，在肝癌細(xì)胞中，Sirtuin 1(SIRT1)可以使YAP2蛋白去乙酰化，增加YAP2和Tead4結(jié)合，增強(qiáng)Trad4的轉(zhuǎn)錄水平，最終導(dǎo)致肝癌的進(jìn)展[17]。

A：流式細(xì)胞術(shù)分選細(xì)胞中CD90、CD105和CD133陽性的細(xì)胞，并通過顯微鏡鏡檢細(xì)胞的微球體形成情況；B：Western blot檢測(cè)SMMC-7721肝癌干細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次圖2 SMMC-7721中肝癌干細(xì)胞的鑒定

A：Western blot檢測(cè)MST1的敲低效果；B：Western blot檢測(cè)MST2的敲低效果；C：鏡檢觀察MST1和MST2敲低后干細(xì)胞微球體形成情況；D：Western blot檢測(cè)肝癌干細(xì)胞中敲低MST1和MST2后干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次圖3 MST1和MST2促進(jìn)了肝癌干細(xì)胞的干性維持

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)MST1和MST2在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中，表達(dá)顯著上調(diào)，提示MST1和MST2在肝癌的進(jìn)程中起著重要的作用。在SMMC-7721細(xì)胞中，通過流式細(xì)胞術(shù)篩選到CD90+、CD105+、CD133+的表型，并發(fā)現(xiàn)這類表型的細(xì)胞，微球體的形成能力顯著變強(qiáng)，提示SMMC-7721細(xì)胞可以作為一個(gè)很好的細(xì)胞模型來進(jìn)行肝癌干細(xì)胞的研究。因此在SMMC-7721 CD90+、CD105+、CD133+型的細(xì)胞中，筆者敲低了MST1和MST2，結(jié)果表明敲低MST1和MST2均能顯著抑制微球體的形成，并且干細(xì)胞標(biāo)志物AMPK的磷酸化水平顯著下調(diào)，OCT-4和Nanog的表達(dá)也被顯著抑制。本研究的結(jié)果作為Hippo信號(hào)通路在肝癌干細(xì)胞中的初步探索，很好地證實(shí)了抑制Hippo信號(hào)通路活性可以抑制肝癌干細(xì)胞的自我更新和干性維持，為Hippo信號(hào)通路在肝癌中的研究開辟了新的思路。