基于HPLC-ELSD法的銀柴胡中甾醇類成分含量測(cè)定

王秀芬，李 靜，方光明，馬學(xué)琴

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750001)

1 儀器與試藥

1.1儀器 1220型高效液相色譜儀，1260B型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)；CPA225D型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；XPE26型百萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；YER-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市予華儀器有限公司)；FW135型中藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；15C4390型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2試藥 本實(shí)驗(yàn)藥材采自內(nèi)蒙、陜西、甘肅和寧夏，經(jīng)杭州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥室主任吳曉寧教授鑒定為石竹科植物StellariadichotomaL.var.lanceolataBge.的干燥根。α-菠甾醇(批號(hào)ZZS-20-106-A6，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%)、豆甾-7-烯醇(批號(hào)3632-091A4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.5%)，均購(gòu)于上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純(Fisher Chemical公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用SHIMADZU Shim-pack GIST C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；ELSD參數(shù)：載氣流速為1.6 L·min-1；漂移管溫度：70 ℃；噴霧器溫度：30 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水(98∶2)；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：50 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液 精密稱取α-菠甾醇對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成質(zhì)量濃度為0.215 mg·mL-1的α-菠甾醇對(duì)照品溶液；精密稱取豆甾-7-烯醇對(duì)照品適量，置于50 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.174 mg·mL-1的豆甾-7-烯醇對(duì)照品溶液。置于冰箱內(nèi)冷藏。

2.2.2供試品溶液 精密稱取銀柴胡粉末(過(guò)3號(hào)篩)6.0 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W，頻率20 kHz)處理40 min，取出，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，濾液用0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.3系統(tǒng)適用性及專屬性考察 分別精密吸取2.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶劑(甲醇)各50 μL，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可知，供試品色譜圖中出現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，2種成分峰的理論塔板數(shù)均不低于2 000，分離度均大于1.5，陰性對(duì)照無(wú)對(duì)應(yīng)色譜峰，說(shuō)明陰性對(duì)照對(duì)2種成分的測(cè)定無(wú)干擾，所建立的色譜條件專屬性良好。

圖1 HPLC-ELSD圖

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項(xiàng)下制備的α-菠甾醇對(duì)照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成質(zhì)量濃度為10.77、17.23、21.54、32.32、38.78、43.09 μg·mL-1的α-菠甾醇系列對(duì)照品溶液。另精密吸取2.2項(xiàng)下制備的豆甾-7-烯醇對(duì)照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為8.7、23.2、34.8、46.4、58.0、69.6、81.2 μg·mL-1的豆甾-7-烯醇系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液各50 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。分別以各對(duì)照品峰面積對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(y)、進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果2種成分回歸方程分別為y1=1.595 2x1+4.719 2(r1=0.998 3)，y2=1.488 3x2+4.801 6(r2=0.999 5)，質(zhì)量濃度分別在10.77～43.09、8.70～81.20 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5檢測(cè)限和定量限考察 精密量取2.2項(xiàng)下制備的α-菠甾醇對(duì)照品溶液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋，分別以信噪比為2.25∶1與12.34∶1計(jì)算檢測(cè)限和定量限，確定α-菠甾醇的檢測(cè)限為0.107 5 μg，定量限為0.430 0 μg。按照2.2項(xiàng)下方法制備豆甾-7-烯醇對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為174 μg·mL-1)適量，分別以信噪比為5.35∶1、20.56∶1計(jì)算檢測(cè)限和定量限，測(cè)得豆甾-7-烯醇的檢測(cè)限為0.017 4 μg，定量限為0.087 0 μg。

“24以上、40歲以下的軍人，給我站出來(lái)！”馬國(guó)平凝視著在山坳里集合起來(lái)的連隊(duì)，突然大吼一聲，如同平地驚雷。

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的同一供試品溶液(內(nèi)蒙)，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定2種成分的峰面積，記錄色譜圖，計(jì)算RSD值。結(jié)果2種成分峰面積的RSD值分別為2.43%、2.16%，表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取銀柴胡藥材粉末6份(內(nèi)蒙)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定2種成分的峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果2種成分的平均含量(n=6)分別為0.017%、0.048%，RSD值分別為2.74%、2.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的同一供試品溶液(內(nèi)蒙)，分別在0、2、4、6 h進(jìn)樣50 μL，分別測(cè)定2種成分的峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果2種成分的RSD值分別為2.89%、2.04%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取含量已知的銀柴胡樣品粉末6份，置于具塞錐形瓶?jī)?nèi)，按照1∶1的比例分別加入2.2.1項(xiàng)下制得的α-菠甾醇對(duì)照品溶液1.5 mL和豆甾-7-烯醇對(duì)照品溶液5.5 mL，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。分別測(cè)定2種成分的含量，計(jì)算其平均回收率，結(jié)果見表1。由表1可知，2種成分的平均回收率分別為104.04%、96.50%，符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，且RSD值均小于3%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表1 2個(gè)甾醇類成分的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.10樣品測(cè)定 按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)10個(gè)不同批次的銀柴胡藥材中α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 銀柴胡的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1指標(biāo)性成分的選擇 銀柴胡臨床上主治疳積發(fā)熱、骨蒸潮熱等癥[16]，含有甾醇類、環(huán)肽類、黃酮類等多種化學(xué)成分，其中甾醇類成分中的α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇具有抗炎、解熱作用，是銀柴胡除虛熱的主要活性成分，因此選擇這2個(gè)成分作為指標(biāo)性成分建立含量測(cè)定方法。

3.2檢測(cè)器的選擇α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇為紫外末端吸收，無(wú)法使用紫外檢測(cè)器進(jìn)行含量測(cè)定。參考相關(guān)文獻(xiàn)[17-19]，建立銀柴胡中甾醇類活性成分的定量分析方法，同時(shí)對(duì)檢測(cè)器漂移管溫度、噴霧器溫度、載氣流速等進(jìn)行考察，結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、靈敏、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高。

3.3流速的選擇 對(duì)色譜條件流動(dòng)相的流速進(jìn)行考察，流速分別設(shè)定為0.8、1.0、1.2 mL·min-1，取供試品溶液，分別按照上述不同流速下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。流速為0.8 mL·min-1時(shí)，30 min內(nèi)樣品未出峰；流速為1.2 mL·min-1時(shí)，2種成分均未達(dá)到良好的分離效果；流速為1.0 mL·min-1時(shí)，在30 min內(nèi)樣品出峰，且2種成分分離效果較好。因此流速選擇1.0 mL·min-1。

3.4提取溶劑的選擇 根據(jù)2種成分的性質(zhì)，選擇甲醇、乙醇、氯仿等溶劑進(jìn)行提取[20]，超聲提取40 min后，放冷，濾過(guò)，作為供試品溶液，對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，其中甲醇與氯仿中2種成分的含量較高，提取效果較好，考慮到甲醇毒性小，對(duì)環(huán)境和人體健康影響小，成本低，最終確定甲醇作為提取溶劑。

3.5提取時(shí)間的選擇 使用甲醇作為提取溶劑，采用超聲處理，分別提取20、30、40、50 min，對(duì)銀柴胡2種成分的含量進(jìn)行考察，結(jié)果提取時(shí)間為40 min時(shí)2種成分的含量較高，超聲處理40 min后含量變化不大，因此制備供試品選擇超聲處理40 min。

本研究采用HPLC-ELSD法建立了銀柴胡藥材中甾醇類成分α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇的含量測(cè)定方法，為銀柴胡藥材的質(zhì)量控制提供了簡(jiǎn)便、高效的方法，為提升銀柴胡藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。