黃蘭婷，倪浩為，李新宇，孫 波，梁玉婷?

（1.常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇常州 213164；2.土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京210008；3.污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院應(yīng)用生態(tài)研究所），沈陽 110164）

土壤具有高度的空間異質(zhì)性，復(fù)雜的土壤孔隙結(jié)構(gòu)為微生物提供了適合的生存空間，不同的微環(huán)境會(huì)影響微生物的豐富度[1]，土壤理化性質(zhì)沿土壤深度的變化會(huì)影響微生物的群落結(jié)構(gòu)及互作。Bahram等[2]研究表明環(huán)境因素和微生物之間的競爭關(guān)系均會(huì)影響微生物群落的結(jié)構(gòu)、組成和功能基因的豐度。深層土壤可能含有與表層土壤不同的且適應(yīng)深層土壤環(huán)境的微生物群落[3-4]，從而表現(xiàn)出不同的生態(tài)功能[5-6]。目前對于土壤微生物的研究大多數(shù)集中在0～20 cm的表層土壤上，對更深層土壤微生物群落空間變化的研究較少[7]，對農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中土壤微生物群落隨土壤深度變化的研究更少[8-9]。研究表明深層土壤微生物在土壤的形成、生物地球化學(xué)循環(huán)過程和污染物降解等方面發(fā)揮著重要的作用[10]。通過水分循環(huán)，深層土壤與表層土壤之間物質(zhì)的流動(dòng)和交換還會(huì)顯著影響表層土壤質(zhì)量從而影響表層植被的生產(chǎn)力[11]。土壤深度的增加會(huì)導(dǎo)致土壤微生物量和多樣性的減少。Du等[12]發(fā)現(xiàn)由于土壤養(yǎng)分含量的不同導(dǎo)致微生物數(shù)量和香農(nóng)指數(shù)均隨深度而下降，且每層土壤中都含有特定的OTU（Operational taxonomic units）。Li 等[13]通過使用磷脂脂肪酸分析方法（phospholipid fatty acid，PLFA）研究稻田土壤中微生物群落隨土壤深度的變化，表明土壤深度的增加，顯著減少了土壤微生物的生物量和多樣性，該結(jié)果意味著土壤含水量和養(yǎng)分含量是不同深度土壤微生物變化的主要驅(qū)動(dòng)因子。土壤深度的增加還可能影響微生物的群落結(jié)構(gòu)。Li等[14]的研究結(jié)果表明水稻土中細(xì)菌群落組成差異隨深度的增加而變大，其中土壤全碳含量（Total carbon，TC）和全氮含量（Total nitrogen，TN）是導(dǎo)致水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要影響因素。此外，土壤深度的增加還可能影響微生物的群落功能。Wang 等[15]通過研究土壤氮循環(huán)相關(guān)基因與土壤深度之間的關(guān)系，表明除amoA-AOA 基因外，其他氮循環(huán)相關(guān)功能基因豐度均隨土壤深度的增加而顯著降低，且這些基因與土壤碳、氮和碳氮比呈顯著正相關(guān)。

過去對微生物的研究大多集中在物種數(shù)量和多樣性上，而不是物種間的相互作用。然而在復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)中，物種間的相互作用對生態(tài)系統(tǒng)的功能可能較物種豐富度和多樣性更為重要[16-17]。微生物之間的相互作用是陸地生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落互作網(wǎng)絡(luò)的組成部分[18-19]。利用生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析法（Ecological network analysis）可以揭示微生物潛在的互作機(jī)制及影響因素[20]，是預(yù)測和改善土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的重要步驟[21]。王丹丹等[22]使用生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析法研究生物炭的添加對土壤根際真菌群落相互作用的影響。Purahong等[23]使用生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的分析方法研究了凋落物分解過程中細(xì)菌和真菌群落的交互作用模式，證明微生物群落變化和相互作用驅(qū)動(dòng)了凋落物分解的不同階段。

為揭示典型紅壤水稻土剖面微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)特征，本研究選擇江西鷹潭典型紅壤水稻土作為實(shí)驗(yàn)對象，采集0～100 cm的5個(gè)剖面土壤，研究上層（0～20 cm），中層（20～60 cm）和下層（60～100 cm）不同深度紅壤細(xì)菌和真菌的互作關(guān)系特征。通過對細(xì)菌16S rRNA和真菌18S rRNA的高通量測序，在前期研究的基礎(chǔ)上[13-15]，利用生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析法構(gòu)建三了個(gè)不同深度土壤微生物群落互作網(wǎng)絡(luò)，以揭示紅壤剖面不同深度微生物的界內(nèi)及界間互作關(guān)系，并且利用隨機(jī)森林和VPA兩種分析方法探討了影響微生物互作關(guān)系的環(huán)境因素。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采集于江西鷹潭地區(qū)（116°54′–116°56′E，28°10′–28°13′N，海拔 34～62 m）晚稻收獲后期（2014年10月至11月）。在該地區(qū)隨機(jī)選擇5個(gè)地點(diǎn)（每個(gè)地點(diǎn)相距至少3 km）采集5個(gè)重復(fù)樣品，這些地點(diǎn)均具有土壤類型、耕作制度和氣候條件等變量變化較小的特點(diǎn)。在每個(gè)地點(diǎn)，使用螺旋鉆按照以下深度間隔（cm）垂直采集土壤樣本：0～10、10～20、20～40、40～60、60～80 和 80～100，共30個(gè)樣本[14]。

1.2 土壤理化性質(zhì)的測定

土壤含水率使用重量法測定?？扇苄杂袡C(jī)碳（Dissolved organic carbon，DOC）使用Multi N/C 3100分析儀（Analytitik Jena AG，Jena，Germany）測定。-N和-N使用AA3 Continuous Flow Analyzer分析儀（Seal Analytic，Germany）測定。土壤全碳和全氮使用vario MICRO cube（Elementar Corporation，Germany）測定。

1.3 DNA提取及高通量測序

使用FastDNA SPIK Kit土壤旋轉(zhuǎn)試劑盒（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）從0.5 g凍干土中提取土壤脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和納米滴分光光度計(jì)（NanoDrop，Wimmington，DE，USA），測定DNA的質(zhì)量和濃度。測定合格的30個(gè)樣品的DNA在–20℃下儲(chǔ)存。

細(xì)菌 16S rRNA的擴(kuò)增引物序列是 Bacteria-341F=5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，Bacteria-758R=5′-CTACCAGGGTATCTAATCC-3′。PCR 擴(kuò)增的條件為：變性95 ℃、10 s ，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、45 s，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸45次。真菌18S rRNA的擴(kuò)增引物序列是Fungal-FR1=5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3 ′，F(xiàn)ungal-FR390=5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′。PCR擴(kuò)增的條件為：變性95 ℃、10 s，退火50 ℃、30 s，延伸72℃、45 s，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸45次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)測序得到的細(xì)菌和真菌的OTU數(shù)據(jù)，使用Cytoscape軟件中的 CoNet插件構(gòu)建微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。分析步驟和網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的選擇參考顧靜馨[24]。網(wǎng)絡(luò)分析中選擇四種相關(guān)分析方法，即 Pearson correlation，Spearman correlation，Bray-Curtis dissimilarity和 Kullback-Leibler dissimilarity，起始連接數(shù)設(shè)置為500。然后，采用Benjamini-Hochberg方法標(biāo)準(zhǔn)化處理相關(guān)系數(shù)，即校正原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的顯著性P值（P-value），并最終采用校正后的P值，保留P<0.05的相關(guān)OTU構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。利用NetworkAnalyzer工具，獲得網(wǎng)絡(luò)的特征路徑長度、連接數(shù)、節(jié)點(diǎn)數(shù)、群聚系數(shù)、網(wǎng)絡(luò)密度和平均連通度等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。

本研究通過 R軟件的“vegan”數(shù)據(jù)包計(jì)算樣品的豐富度和多樣性。隨機(jī)森林的分析方法是通過對數(shù)據(jù)集中的每一個(gè)解釋變量分別隨機(jī)置換以得到每個(gè)解釋變量對被解釋變量的貢獻(xiàn)程度，以均方誤差（mean square error，MSE）表示。本研究利用R 軟件中的“randomForest”數(shù)據(jù)包進(jìn)行隨機(jī)森林模型的預(yù)測；對模型整體的檢驗(yàn)利用“rfUtilities”數(shù)據(jù)包；隨機(jī)森林中每個(gè)變量對模型貢獻(xiàn)程度的顯著性檢驗(yàn)利用“rfPermute”數(shù)據(jù)包。方差分解分析（Variance Partitioning Analysis，VPA）是一種偏分析法，能夠揭示不同環(huán)境因子對細(xì)菌真菌互作關(guān)系的相對貢獻(xiàn)率大小，本研究使用R軟件中的‘vegan’數(shù)據(jù)包完成。

2 結(jié) 果

2.1 土壤理化性質(zhì)沿深度的變化

隨著土壤深度的增加，土壤理化性質(zhì)如pH、含水率（Soil moisture，SM）、TN、TC和碳氮比（C/N）等均顯著變化（圖1）。例如，土壤pH先增加后減小，在40～60 cm之間土壤的pH最大；與之相反，-N先減小后增加。此外，除DOC和-N的含量隨深度的增加而增加外，TC、TN和C/N均隨土壤深度的增加而減小。

2.2 紅壤剖面微生物的群落豐富度指數(shù)

沿土壤剖面計(jì)算了細(xì)菌和真菌群落的豐富度指數(shù)（圖2）。結(jié)果表明，盡管細(xì)菌和真菌的豐富度指數(shù)沿土壤深度的增加有相同的響應(yīng)模式。但是相比于真菌，細(xì)菌豐富度對土壤深度的響應(yīng)更加敏感。例如：細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)隨深度增加連續(xù)降低（P<0.05）；而真菌群落在60～100 cm深度范圍內(nèi)的豐富度并不隨土壤深度的進(jìn)一步增加而降低。該結(jié)果表明了相比于細(xì)菌而言，真菌群落對資源限制可能有更強(qiáng)的抵抗力。

2.3 紅壤剖面微生物網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系

基于紅壤剖面細(xì)菌真菌豐富度指數(shù)的變化（圖2）及群落結(jié)構(gòu)分布[14]，本研究將0～100 cm土壤劃分為上層（0～20 cm）、中層（20～60 cm）和下層（60～100 cm）?；陲@著相關(guān)性對細(xì)菌和真菌的高通量測序數(shù)據(jù)構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)（圖3），探究細(xì)菌-真菌群落的共現(xiàn)模式，使用 NetworkAnalyzer工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)（表1）。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)的分析表明，隨著土壤深度的增加，網(wǎng)絡(luò)的群聚系數(shù)、平均鄰居數(shù)和網(wǎng)絡(luò)密度均顯著增加，特征路徑長度和網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)則顯著減小。該結(jié)果表明土壤微生物之間的總網(wǎng)絡(luò)互作隨深度的增加而變得復(fù)雜緊密。

表1 三個(gè)不同深度下微生物互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)Table 1 Topological properties of microbial interactions network relative to soil depth

上中下三層土壤微生物互作網(wǎng)絡(luò)圖顯示（圖3a），土壤微生物互作網(wǎng)絡(luò)的模塊化隨深度增加，細(xì)菌、真菌群落界內(nèi)的相互作用增加，其中細(xì)菌以正相互作用為主，真菌以負(fù)相互作用為主。上中下三層土壤微生物互作網(wǎng)絡(luò)在門水平的弦圖（圖3b）表明，細(xì)菌群落界內(nèi)互作主要為酸桿菌門和綠彎菌門，真菌群落界內(nèi)互作主要為子囊菌門和擔(dān)子菌門。在上層網(wǎng)絡(luò)中，細(xì)菌-真菌群落界間的互作復(fù)雜，包含多個(gè)細(xì)菌門類與真菌門類的互作；中層網(wǎng)絡(luò)中，細(xì)菌-真菌群落界間的互作包含的門類減少，主要是酸桿菌門與子囊菌門之間的互作，綠彎菌門與子囊菌門之間的互作；下層網(wǎng)絡(luò)中，細(xì)菌-真菌群落界間的相互作用進(jìn)一步減少，細(xì)菌與真菌群落界內(nèi)的相互作用增加，如酸桿菌門和子囊菌門的自相互作用增加。

進(jìn)一步分析微生物界內(nèi)和界間互作所占比例，細(xì)菌在互作網(wǎng)絡(luò)中的占比隨深度的增加而減少，真菌在互作網(wǎng)絡(luò)中的占比增加；細(xì)菌、真菌群落界內(nèi)互作與深度成正比。

不同深度紅壤互作網(wǎng)絡(luò)中群落之間連接數(shù)的分布情況顯示（圖4），上層土壤的細(xì)菌、真菌群落界內(nèi)互作和細(xì)菌-真菌群落界間互作分別占上層網(wǎng)絡(luò)的 37%、34%和29%，且均以正相互作用為主。中層土壤網(wǎng)絡(luò)中以細(xì)菌群落界內(nèi)正相互作用為主。下層土壤網(wǎng)絡(luò)中以真菌群落界內(nèi)負(fù)相互作用為主。研究結(jié)果進(jìn)一步表明土壤中細(xì)菌-真菌群落界間互作與深度成反比，且細(xì)菌-真菌群落界間互作的正連接數(shù)占總連接數(shù)的占比隨深度的增加顯著減少（上層：18%，中層：6%，下層：3%）。

2.4 紅壤剖面微生物互作網(wǎng)絡(luò)的影響因素

利用隨機(jī)森林進(jìn)一步分析土壤微生物互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫詤?shù)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系（圖5），結(jié)果表明，細(xì)菌、真菌群落界內(nèi)互作和細(xì)菌-真菌群落界間互作的主要影響因素是土壤中的 TC含量（P<0.05），其次為 TN含量（P<0.05）。且環(huán)境因子對細(xì)菌-真菌群落界間互作的解釋量更大。

利用方差分解分析（Variance Partitioning Analysis，VPA）分析土壤pH、SM、C（TC和DOC）和N（TN、-N和-N）對三層土壤微生物互作網(wǎng)絡(luò)的貢獻(xiàn)（圖6）。沿土壤剖面上中下三層微生物互作網(wǎng)絡(luò)的總解釋量分別為77.50%、92.29%和74.12%，土壤中的C和N是影響微生物互作網(wǎng)絡(luò)的主要因素，且隨著土壤深度的增加，土壤C的解釋量從3.58%增至32.67%。VPA結(jié)果表明表層土壤微生物更加受到N的影響而深層土壤微生物更加受到土壤C的影響，隨著深度的增加，影響微生物相互作用的環(huán)境因素由N轉(zhuǎn)變?yōu)镃。

3 討 論

本研究通過構(gòu)建分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，探究了紅壤水稻土剖面細(xì)菌、真菌群落界內(nèi)及界間的相互作用及其影響因素。研究表明，盡管細(xì)菌和真菌的豐富度隨土壤深度降低（圖2），但整體微生物互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)顯著增強(qiáng)（表1），表明相比于表層土壤，深層土壤微生物之間有更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)相互作用。這可能是由于農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中作物根系分泌物和地表凋落物主要增加了表層土壤中有機(jī)質(zhì)的含量，并且施肥使表層土壤和深層土壤的養(yǎng)分差距變大，從而養(yǎng)分有效性隨土壤深度不同而顯著變化[25]，導(dǎo)致表層土壤微生物多樣性高而深層土壤微生物多樣性低，

微生物因土壤養(yǎng)分的減少而相互作用增加。這與Gu[26]和 Li[27]等的研究結(jié)果一致——施肥會(huì)引起土壤性質(zhì)的改變從而顯著影響土壤微生物群落的組成及相互作用，深層土壤微生物互作網(wǎng)絡(luò)較表層土壤微生物互作網(wǎng)絡(luò)更加緊密復(fù)雜。資源的限制會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌和真菌群落的相互作用由協(xié)作轉(zhuǎn)變?yōu)楦偁嶽19]。本研究中微生物之間的負(fù)相互作用隨深度的增加而增加（圖3），這可能是由于土壤中碳和氮含量隨深度增加而減少，從而導(dǎo)致微生物之間的競爭作用加強(qiáng)。Banerjee等[28]的研究結(jié)果表明，豐富的有機(jī)物和營養(yǎng)物會(huì)使微生物互作網(wǎng)絡(luò)的負(fù)相互作用減少。

土壤微生物會(huì)借助趨化感應(yīng)游向具有豐富營養(yǎng)物質(zhì)的根際附近進(jìn)行定殖與繁殖[29]，豐富的資源環(huán)境有利于微生物的生長與物質(zhì)交換。隨著土壤深度的增加，土壤孔隙度減小，養(yǎng)分含量持續(xù)下降，影響了土壤微生物在充足營養(yǎng)源條件下的互作[30]，導(dǎo)致細(xì)菌、真菌群落界內(nèi)互作增加，而界間互作減少（圖4）。有研究指出，土壤高 C/N有利于真菌生長，低C/N有利于細(xì)菌生長[29，31-32]。本研究與之相反，在較高C/N的中層土壤主要以細(xì)菌群落界內(nèi)的正相互作用為主，在較低C/N的深層土壤主要以真菌群落界內(nèi)的負(fù)相互作用為主，可能是由于表層土壤中含有大量易降解有機(jī)碳而深層土壤中的有機(jī)碳以難降解有機(jī)碳為主[33-34]，細(xì)菌更偏向于利用易降解有機(jī)碳，真菌更偏向于利用難降解有機(jī)碳[35-36]，所以導(dǎo)致表層土壤更適合細(xì)菌生長而深層土壤更適合真菌生長。Huang等[37]的研究表明不同深度稻田土壤剖面，微生物群落利用的碳源種類不同。細(xì)菌-真菌群落界間互作不僅會(huì)受到環(huán)境因素的影響還會(huì)受到土壤中其他生物相互作用的影響[18]。本研究紅壤細(xì)菌群落界內(nèi)互作主要以正相互作用為主，真菌群落界內(nèi)互作沿土壤剖面由正相互作用為主轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)相互作用為主（圖4）。Eldridge 等[38]的研究結(jié)果表明，土壤微生物網(wǎng)絡(luò)中細(xì)菌和真菌的接連差異主要取決于土壤受到的干擾程度，環(huán)境干擾會(huì)增加微生物群落結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性[39]。供試土壤是典型水稻土，施肥增加了表層土壤養(yǎng)分含量。微生物之間的相互作用主要是受到養(yǎng)分的驅(qū)動(dòng)，豐富的資源會(huì)減少微生物之間的負(fù)相互作用[21，28]，隨著土壤深度的增加，土壤養(yǎng)分含量減少，競爭性的相互作用在資源相對短缺時(shí)可能更加重要[21]，所以真菌需要通過競爭性的相互作用來滿足自身的需求。研究表明，根際土壤中的碳首先會(huì)被腐生真菌利用[40]。深層土壤中受到可利用碳組分的限制，細(xì)菌群落需要通過正相互作用來緩解環(huán)境的脅迫，同時(shí)擴(kuò)大自己的生態(tài)位，以更好地獲取資源[41]。

已有報(bào)道表明，微生物群落結(jié)構(gòu)和功能隨土壤剖面的變化顯著受到土壤中TN和TOC的影響[42]。本研究對典型紅壤水稻土的分析表明，土壤中C和N是影響細(xì)菌和真菌互作的主要因素（圖5），且隨土壤深度的增加，對微生物互作網(wǎng)絡(luò)的主要貢獻(xiàn)因素由N轉(zhuǎn)變?yōu)镃（圖6）。Jangid 等[43]的研究結(jié)果表明，微生物群落的差異與土壤可礦化的 C、N含量和可提取的養(yǎng)分含量有關(guān)。Wan等[44]的研究結(jié)果表明，施氮肥會(huì)降低土壤 C/N，進(jìn)而改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。氮肥的施加會(huì)降低表層土壤微生物生物量及細(xì)菌/真菌的比例[45]，所以N是表層土壤微生物互作的主要貢獻(xiàn)因素。由于土壤C-N轉(zhuǎn)化過程密切的偶聯(lián)效應(yīng)，土壤有機(jī)質(zhì)分解受到土壤N養(yǎng)分的控制。氮肥的添加緩和了表層土壤中N對微生物的限制，減輕了微生物需要通過礦化惰性有機(jī)質(zhì)以獲取N的需求，使r策略微生物獲得更強(qiáng)的競爭優(yōu)勢[46]。相比之下，深層土壤中可利用的碳源和氮源急劇減少，深層土壤微生物受到 C的影響增加。Fierer等[7]的研究結(jié)果表明，土壤碳的可利用性隨深度增加而下降，深層土壤微生物較表層土壤微生物更加受到土壤中C含量的限制，土壤中的C含量是細(xì)菌和真菌群落互作的主要驅(qū)動(dòng)因素。

4 結(jié) 論

典型紅壤水稻土微生物相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)如網(wǎng)絡(luò)的連通度、群聚系數(shù)和網(wǎng)絡(luò)密度等均與土壤的深度成正比；土壤深度越深，微生物的相互作用越緊密，模塊化越明顯，且細(xì)菌、真菌群落界內(nèi)互作增加而細(xì)菌-真菌群落界間互作減弱。上層土壤以正相互作用為主，中層土壤以細(xì)菌群落界內(nèi)正相互作用為主，下層土壤以真菌群落界內(nèi)負(fù)相互作用為主。這主要受到土壤中C和N含量的影響，且隨著土壤深度的增加，土壤中C對微生物互作網(wǎng)絡(luò)影響顯著增加，微生物互作網(wǎng)絡(luò)最主要的貢獻(xiàn)因素由N轉(zhuǎn)變?yōu)镃。