饒鴻宇，諶攀，李沛波，關(guān)敏怡，蘇薇薇

廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心/ 廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室/ 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510275

重癥肺炎是由細(xì)菌和病毒等侵襲肺部組織所引起的感染性疾病，常伴有呼吸困難和多器官功能障礙等并發(fā)癥，為臨床危重癥。經(jīng)積極搶救治療后，重癥肺炎的死亡率有所降低，但患者仍易存在呼吸道損傷和免疫功能尚未完全恢復(fù)等問題，嚴(yán)重降低了他們的生活質(zhì)量，因此重癥肺炎康復(fù)期的治療也十分重要。2018 年，由中國康復(fù)醫(yī)學(xué)會等機構(gòu)制定的《中國呼吸重癥康復(fù)治療技術(shù)專家共識》將中醫(yī)傳統(tǒng)康復(fù)療法納入呼吸重癥康復(fù)治療當(dāng)中，該指南指出針對部分患者出現(xiàn)脾肺氣虛或脾腎兩虛等癥狀，可進(jìn)行中醫(yī)辨證論治［1］。

由補骨脂、赤芍和黃芪制成的補肺活血膠囊被廣泛應(yīng)用于慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘和肺纖維化等氣虛血瘀證的治療，臨床療效顯著。2020 年，針對全國蔓延的新型冠狀病毒肺炎，安徽、貴州和北京等地先后將補肺活血膠囊納入中醫(yī)藥診療方案，用于新冠肺炎患者康復(fù)期的治療，緩解患者肺脾氣虛的癥狀，加速患者康復(fù)［2］。本團(tuán)隊前期針對補肺活血膠囊的化學(xué)組成進(jìn)行了研究，系統(tǒng)的闡述了其物質(zhì)組成和藥材歸屬，為其藥效作用機制的研究奠定了良好的基礎(chǔ)［3-5］。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)運用計算機技術(shù)，對疾病、藥物和靶點進(jìn)行關(guān)聯(lián)，可以揭示藥物對機體多層面的影響，為闡明中藥復(fù)方的整體作用機制提供了新的研究思路［6］。本研究首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對肺炎患者康復(fù)后期使用補肺活血膠囊進(jìn)行干預(yù)的藥效作用機制進(jìn)行研究，為補肺活血膠囊促進(jìn)肺炎患者的痊愈提供科學(xué)依據(jù)。

1 方 法

1.1 補肺活血膠囊化學(xué)成分收集

基于UFLC-Triple TOF MS/MS 技術(shù)，本團(tuán)隊已對補肺活血膠囊的化學(xué)組成進(jìn)行了研究，共指認(rèn)了包括同分異構(gòu)體在內(nèi)44 個化合物，其中23 個來自補骨脂，13 個來自赤芍，11 個來自黃芪，揭示了補肺活血膠囊的物質(zhì)組成和成分歸屬［4］。

1.2 核心靶點的指認(rèn)及藥材-關(guān)鍵成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運 用 TCMSP（http：//tcmspw. com/）和 CTD（https：//ctdbase. org/）數(shù)據(jù)庫檢索補肺活血膠囊化學(xué)成分作用的靶點，并通過Uniprot（https：//www.uniprot. org/）和Drugbank（https：//www. drugbank.ca/）等數(shù)據(jù)庫將其中的蛋白靶點轉(zhuǎn)化成與人相關(guān)的基因靶點，再將未檢索到靶標(biāo)的化合物導(dǎo)入SwissTargetPrediction（http：//www. swisstargetpredic?tion.ch/）對其進(jìn)行作用靶點的預(yù)測，同時對搜集到的所有靶基因進(jìn)行整合。將整理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入String（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，選定研究目標(biāo)為人種（Homo Sapiens），進(jìn)行蛋白互作分析（PPI），并對結(jié)果開展網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，找出補肺活血膠囊作用的核心靶基因［7］。將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 進(jìn)行可視化，構(gòu)建藥材-關(guān)鍵成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖，并分析其結(jié)構(gòu)特征。

1.3 核心靶點功能富集分析和通路分析

為進(jìn)一步探究補肺活血膠囊的作用機制，本研究基于DAVID v6.7 數(shù)據(jù)庫（https：//david. ncif?crf. gov/）對上述核心靶基因進(jìn)行研究，將物種限定為人種（Homo Sapiens），分析其生物學(xué)功能（Gene Ontology，GO 分析）和通路信息（Kyoto Ency?clopedia of Genes and Genomes，KEGG分析）［7］。

2 結(jié) 果

2.1 化學(xué)成分的收集及核心靶點的篩選

共搜集到補肺活血膠囊成分作用的靶點共1 102個，經(jīng)PPI分析（見圖1），得到核心靶點215個，涉及關(guān)鍵成分共42 個（其中10 個來自黃芪，13 個來自赤芍，22個來自補骨脂），用于網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

圖1 1 102個靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 The PPI network of 1 102 target

2.2 核心靶點的指認(rèn)及藥材-關(guān)鍵成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)分析

由Cytoscape 建立的藥材-關(guān)鍵成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖共包括262 個節(jié)點（3 味藥材，44 個化合物，215 個核心靶點）和10 206 條邊（圖2）。在這44 個化合物中，Degree 評分前5 的成分為Puerarin（葛根素）、Daidzein（大豆黃酮）、Ellagic Acid（鞣花酸）、Gallic Acid（沒食子酸）和Procyanidin B2（原花青素B2），是補肺活血膠囊發(fā)揮功效的關(guān)鍵化合物；Degree 評 分 前15 的 核 心 靶 點 是AKT1、MAPK3、VEGFA、CASP3、EGFR、GAPDH、INS、TP53、SRC、ALB、IL6、TNF、MAPK1、STAT3 和MAPK8，為補肺活血膠囊潛在的作用靶點。

圖2 藥材-成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The herb-component-key target network

2.3 核心靶點生物學(xué)功能分析和通路分析

GO 分析共確定了1 058 個條目（圖3），包括與藥物反應(yīng)、凋亡過程負(fù)調(diào)控和細(xì)胞增殖的正調(diào)控等方面相關(guān)的生物過程相關(guān)條目811 個（77%），與酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合和蛋白激酶綁定等方面相關(guān)的分子功能條目153 個（14%）和主要細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核漿等方面相關(guān)的細(xì)胞組成條目94個（9%）。KEGG 分析共篩選出P<0.05 的通路143條（P值越小，富集程度越高），其中T Cell Recep?tor Signaling Pathway、 TNF Signaling Pathway 和Rap1 Signaling Pathway 等與炎癥免疫調(diào)控密切相關(guān)，HIF-1 signaling pathway 和PI3K-Akt Signaling Pathway 等與肺纖維化調(diào)控密切相關(guān)，Hepatitis B和Influenza A 通路等與病毒性疾病密切相關(guān)，是補肺活血膠囊發(fā)揮功效的潛在作用通路（圖4）。

圖3 補肺活血膠囊核心靶點GO富集分析結(jié)果Fig.3 GO enrichment analysis of the key targets

圖4 補肺活血膠囊核心靶點KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.4 Pathway enrichment analysis of the key targets

3 討 論

重癥肺炎是由于肺部炎癥惡化引起器官功能障礙的呼吸系統(tǒng)急危重癥，具有極高的死亡率。臨床上重癥肺炎患者體內(nèi)起初表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞的增多和彌漫性肺泡損傷，隨著病情的發(fā)展，逐漸出現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞的損傷和肺間質(zhì)的纖維化，影響呼吸道的通氣換氣功能，進(jìn)而導(dǎo)致低氧血癥，引發(fā)生理功能紊亂和代謝異常等。此外，隨著大量炎性介質(zhì)釋放入血，會誘發(fā)免疫級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致多器官功能衰竭，導(dǎo)致患者死亡。因此，重癥肺炎患者的治療常通過改善通氣和建立有效體內(nèi)循環(huán)以維持患者生命體征，其中呼吸機輔助通氣和有創(chuàng)機械通氣是重癥肺炎搶救過程中最有效的方法之一。然而，有研究指出，該療法會引發(fā)呼吸機所致肺損傷和肺纖維化等并發(fā)癥［8-9］。因此，在重癥肺炎患者的康復(fù)期，還需進(jìn)行相應(yīng)的康復(fù)治療，預(yù)防患者肺功能退化，提高患者的生存質(zhì)量［10］。

由補骨脂、赤芍和黃芪制成的補肺活血膠囊主要含有黃酮、酚酸、單萜、香豆素和皂苷等多種化合物，現(xiàn)已廣泛用于臨床呼吸道疾病的治療?！栋不帐⌒滦凸跔畈《痉窝字嗅t(yī)藥治療專家共識（試行）》指出針對部分肺部炎癥吸收不良或存在肺部機化的新冠肺炎患者，可隨證使用補肺活血膠囊，加速患者康復(fù)［2］。敬岳等［11-12］的研究表明補肺活血膠囊不僅能降低由PM2.5引起的肺纖維化小鼠的炎癥因子的水平，改善肺組織炎性損傷，還可以抑制細(xì)顆粒物懸液引起的小鼠肺部損傷，降低角質(zhì)細(xì)胞生長因子的含量，減少肺組織纖維樣變。也有臨床研究表明補肺活血膠囊還可提升煤工塵肺病人的肺功能水平，改善臨床癥狀和血氣指標(biāo)［13-14］。綜上所述，補肺活血膠囊具有減輕患者肺部炎癥反應(yīng)，改善患者體征的功效，有利于患者的康復(fù)。本文深入探究了補肺活血膠囊中的活性化合物，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對其作用機制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)補肺活血膠囊中發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)為葛根素、大豆黃酮、原花青素B2、鞣花酸和沒食子酸等。葛根素、大豆黃酮和原花青素B2均為黃酮類化合物，能夠降低炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎和抗氧化的功效，治療LPS引起的小鼠急性肺損傷［15-17］。Hu 等［18］發(fā)現(xiàn)葛根素還可以調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3 通路，緩解肺纖維化的形成，治療嬰兒急性呼吸窘迫綜合征。此外，Lee 等［19］研究指出大豆黃酮能影響?zhàn)ひ核氐尼尫?，可用于改善新冠肺炎患者痰少而粘的癥狀。鞣花酸和沒食子酸均為酚酸類化合物，含有大量的酚羥基，可以降低細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平，減弱細(xì)胞收到的氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮抗氧化和抗炎的作用；研究發(fā)現(xiàn)它們還能緩解博來霉素引起的大鼠肺纖維化，發(fā)揮肺保護(hù)作用［20-21］。由此可見，補肺活血膠囊中的葛根素、大豆黃酮、鞣花酸和沒食子酸等關(guān)鍵成分在呼吸系統(tǒng)疾病中具有多種生物學(xué)活性，有效的促進(jìn)了新冠肺炎患者的康復(fù)。

清除炎癥因子和阻斷細(xì)胞因子風(fēng)暴一直是救治肺炎危重癥患者的重要措施之一，即使在恢復(fù)期，肺炎患者仍存在明顯的“免疫-炎癥”失衡。本研究發(fā)現(xiàn)補肺活血膠囊對TNF、T Cell Receptor（TCR）和Rap1 等與炎癥相關(guān)的通路具有一定的影響，可發(fā)揮促進(jìn)肺炎患者康復(fù)的作用。TNF是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的細(xì)胞因子家族，可與細(xì)胞膜表面的TNFR1 和TNFR2 結(jié)合完成活化，激活與細(xì)胞凋亡相關(guān)的MAPK-JNK 和NF-κB 等多條信號通路以及與機體炎癥相關(guān)的磷脂酶A2 和5-脂氧合酶等多個蛋白。同時，活化的TNFR 還能刺激IL-1、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)一步加重機體的炎癥反應(yīng)［22］。TCR 可被特異性抗原及多種細(xì)胞因子所激活，從而誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化增多，促進(jìn)IL-2 等細(xì)胞因子的釋放；也可上調(diào)鈣蛋白酶活性，進(jìn)一步促進(jìn)IL-4 和IL-7 的水解；還能激活蛋白酪氨酸磷酸酶、細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白抑制劑（STAT）等，抑制細(xì)胞因子反應(yīng)［23］。Rap1 受上游信號cAMP 刺激時，可與GTP 結(jié)合，使細(xì)胞粘連收緊，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的修復(fù)，阻斷炎癥反應(yīng)；還可減少ICAM1 的生成，抑制白細(xì)胞的粘附和遷移，減輕機體的炎癥反應(yīng)［24］。此外，Cai 等［25］發(fā)現(xiàn)Rap1 的低表達(dá)可以降低巨噬細(xì)胞中TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)，抑制細(xì)胞因子的生成。

肺纖維化是一種由不明原因引起的伴有成纖維細(xì)胞大量增殖的慢性進(jìn)展性肺疾病，具有潛伏期長、起病隱匿的特點。張麗霞等［26］的研究指出彌漫性間質(zhì)肺纖維化是SARS 肺炎患者治愈后出現(xiàn)的發(fā)病率最高的后遺癥之一。鐘飛揚等［27］對30例新冠肺炎患者的胸部影像學(xué)資料進(jìn)行分析，指出新冠肺炎患者早期就存在以肺部磨玻璃影或?qū)嵶優(yōu)橹饕卣鞯亩喟l(fā)性病灶，可能會誘發(fā)肺纖維化的形成，極大的阻礙了患者的康復(fù)。因此，在重癥肺炎患者康復(fù)過程中避免肺纖維化的產(chǎn)生成為了臨床治療過程中不可避免的難題之一。本文發(fā)現(xiàn)補肺活血膠囊可作用于PI3K-Akt、HIF-1 和FoxO 等與肺纖維化相關(guān)的通路，預(yù)防重癥肺炎患者康復(fù)期可能出現(xiàn)的肺纖維化等后遺癥。PI3K 可被酪氨酸激酶受體和細(xì)胞因子受體等多種細(xì)胞膜受體激活，參與細(xì)胞增殖和肺損傷調(diào)節(jié)［28］。Xie等［29］對LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 可通過調(diào)控下游的mTOR 蛋白激酶，抑制自噬的發(fā)生，緩解了肺成纖維細(xì)胞的凋亡，加速肺纖維化的形成。HIF-1常在低氧、生長因子和癌基因等因素的刺激下完成活化，也可被活化的Akt 激活，維持組織和細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，使細(xì)胞適應(yīng)缺氧狀態(tài)。同時，諸多研究表明過度活化的HIF-1會導(dǎo)致肺泡表面活性物質(zhì)生成不足，形成缺氧環(huán)境，加重肺損傷，更會促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的分化，加速肺纖維化的形成［30-31］。FoxO 是Akt 激酶的靶蛋白之一，在細(xì)胞的氧化應(yīng)激、增殖分化和細(xì)胞凋亡過程中扮演著非常重要的角色［32］。Artham 等［33］發(fā)現(xiàn)FoxO1/3a 的低表達(dá)可加重LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺水腫，該作用機制與其影響內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)溶素1 的表達(dá)有關(guān)。Im 等［34］的研究表明FoxO3a 的低表達(dá)可下調(diào)肺纖維化患者體內(nèi)成纖維細(xì)胞的自噬，從而對Ⅰ型膠原基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抵抗，助力肺纖維化。

綜上所述，補肺活血膠囊中的關(guān)鍵成分群可通過多靶點多通路抑制機體炎癥，降低患者肺纖維化出現(xiàn)的可能性，加速患者的康復(fù)。本研究闡明了補肺活血膠囊促進(jìn)重癥肺炎患者康復(fù)的關(guān)鍵成分及作用機制，為補肺活血膠囊的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。