李洪 杜小芳 程勇

遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(遵義市第一人民醫(yī)院)康復(fù)醫(yī)學(xué)科一病區(qū)，貴州 遵義 563000

近年來(lái)，隨我國(guó)人口老齡化加劇，骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病率日益增高[1]，胸腰段椎體作為其高發(fā)部位，患病率約占脆性骨折總?cè)藬?shù)的53%[2-3]，具有較高的致殘率及病死率，現(xiàn)已逐漸成為嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。研究表明，個(gè)體營(yíng)養(yǎng)、遺傳因素、環(huán)境因素及生活習(xí)慣等均為胸腰段骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折(osteoporotic vertebral compression fracture，OVCF)發(fā)生危險(xiǎn)因素[4-5]，其中遺傳因素對(duì)個(gè)體成長(zhǎng)過(guò)程中峰值骨量的影響高達(dá)70.0%[6]。同時(shí)人類(lèi)全基因組序列顯示，基因突變一定程度會(huì)改變骨密度，增加骨折風(fēng)險(xiǎn)[7]。因此，研究基因等相關(guān)遺傳因素與老年OVCF的關(guān)系及潛在發(fā)病機(jī)制是目前的主要方向。研究證實(shí)，維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)基因多態(tài)性與骨折風(fēng)險(xiǎn)存在一定關(guān)聯(lián)性[8]，然而VDR基因多態(tài)性與老年OVCF患者骨密度及半定量分型仍需相關(guān)循證支持。鑒于此，本研究分析VDR基因多態(tài)性與老年OVCF患者骨密度及半定量分型的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016年3月至2019年3月我院94例老年OVCF患者作為觀(guān)察組，另選取同期來(lái)我院進(jìn)行健康體檢的老年健康者94名作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)觀(guān)察組均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)磁共振成像(MRI)或CT三維重建證實(shí)；②骨密度檢查顯示骨質(zhì)疏松或骨量減少；(2)對(duì)照組經(jīng)MRI或CT三維重建均未發(fā)現(xiàn)椎體壓縮性骨折；(3)兩組年齡>60歲，臨床資料完整，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥所致內(nèi)分泌疾病者；(2)近6個(gè)月內(nèi)有性激素、維生素D、糖皮質(zhì)激素或抗骨質(zhì)疏松藥物服用史者；(3)合并椎體原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤者；(4)合并肝腎等重要臟器器質(zhì)性病變者；(5)精神行為異常者。

1.2 方法

1.2.1自制調(diào)查表：根據(jù)臨床相關(guān)資料、文獻(xiàn)進(jìn)行自制調(diào)查表，調(diào)查內(nèi)容主要包括性別、年齡、合并癥、骨折節(jié)段、病變節(jié)段、血磷、鈣濃度。其中血磷、鈣濃度均采用全自動(dòng)生化分析儀(貝克曼庫(kù)爾特AU680)檢測(cè)，嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2VDR基因測(cè)定：采用酚和氯仿抽提法提取白細(xì)胞DNA，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，引物序列：上游引物：5’-CAACCAAGACAAGTACCGTACCGCGTCAGTGA-3’；下游引物：5’-TGGCGGCAGCGGATGTACGTCTGC-3’。特異性擴(kuò)增產(chǎn)物片段為1 850 bp，試劑盒購(gòu)自錸博(上海)生化科技有限公司。采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RELP)分析VDR基因型，反應(yīng)體系25 μL(即10×buffer 2.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶非底物0.5 μL，引物各1 μL，雙蒸水17 μL，模板1 μL，TagDNA聚合酶0.5 μL，氯化鎂1.5 μL)，反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，復(fù)性61 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 90 s，上述步驟循環(huán)35次，最后延伸72 ℃ 10 min。產(chǎn)物4 μL，樣液1 μL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(1.5%)，電壓110 v，持續(xù)20 min，溴化乙啶染色，置入凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察擴(kuò)增。后直接采用限制性BSM I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，37 ℃ 4 h。反應(yīng)終止后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(1.5%)，溴化乙啶染色，參照DNA片段長(zhǎng)度，采用凝膠成像系統(tǒng)獲取結(jié)果。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)

比較兩組臨床資料。分析VDR基因型與老年OVCF的關(guān)系。比較不同VDR基因型患者一般資料。比較不同VDR基因型患者半定量分型，其中20.0%≤椎體前緣壓縮≤25.0%，10.0%≤椎體投影面積下降≤20.0%為Ⅰ型(輕度壓縮)；25.0%<椎體前緣壓縮≤40.0%，20.0%<椎體投影面積下降≤40.0%為Ⅱ型(中度壓縮)；椎體前緣壓縮及椎體投影面積減少均>40.0%為Ⅲ型(重度壓縮)。采用雙能X線(xiàn)骨密度測(cè)量?jī)x(型號(hào)：Prodigy，購(gòu)自美國(guó)GE公司)比較不同VDR基因型患者骨密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較

兩組年齡、合并癥相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組性別、VDR基因型相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床資料對(duì)比

2.2 VDR基因型與老年OVCF的關(guān)系

以是否發(fā)生老年OVCF為因變量，VDR各基因型為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，VDR-BB基因型為老年OVCF發(fā)生的保護(hù)因素，VDR-Bb、bb基因型為老年OVCF發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 VDR基因型與老年OVCF的多因素分析

2.3 不同VDR基因型患者一般資料

不同VDR基因型患者性別、年齡、骨折節(jié)段、病變節(jié)段、血磷、鈣濃度相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同VDR基因型患者一般資料對(duì)比

2.4 不同VDR基因型患者半定量分型

94例老年OVCF患者共172個(gè)傷椎，VDR-Bb基因型與bb基因型骨折半定量分型例數(shù)及椎體數(shù)分布相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，VDR-Bb基因型老年OVCF患者I型例數(shù)及椎體數(shù)明顯低于VDR-bb基因型患者(P<0.05)，且VDR基因型與骨折半定量分型具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同VDR基因型患者半定量分型對(duì)比

2.5 不同VDR基因型患者骨密度

不同VDR基因型患者胸椎、腰椎骨密度相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且VDR基因型與胸椎、腰椎骨密度無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 不同VDR基因型患者骨密度對(duì)比

3 討論

文獻(xiàn)指出，VDR等位基因多態(tài)性與骨密度、骨轉(zhuǎn)換存在一定關(guān)聯(lián)性，且與人骨生理參數(shù)正常變異相關(guān)，是骨代謝遺傳標(biāo)記[9]。故通過(guò)基因多態(tài)性研究，篩選OVCF發(fā)生高危老年人群，予以早期有效防治。本研究結(jié)果顯示，老年OVCF患者女性比例、VDR基因型高于老年健康者，提示性別、VDR基因型可影響老年OVCF的發(fā)生。

3.1 性別與老年OVCF的關(guān)系

胡笑峰[10]研究表明，與老年男性患者相比，老年女性患者骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生概率較高。同時(shí)，陳輝等[11]共納入120例老年女性骨質(zhì)疏松患者，進(jìn)行單因素與二元Logistic回歸分析，絕經(jīng)時(shí)間早是老年女性發(fā)生骨質(zhì)疏松性股骨頸骨折的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，老年OVCF患者中女性比例明顯高于老年健康者，提示性別可能與老年OVCF發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)性。分析機(jī)制可能在于：(1)隨年齡增長(zhǎng)，老年人群反應(yīng)遲鈍，骨強(qiáng)度下降，髖周肌群退化，導(dǎo)致滑倒或跌倒發(fā)生時(shí)難以有效抵消髖部、胯部等有害應(yīng)力；(2)女性絕經(jīng)后雌激素水平分泌不足，一定程度會(huì)增強(qiáng)骨骼對(duì)甲狀旁腺激素的靈敏度，減弱對(duì)成骨細(xì)胞的刺激，影響骨吸收，進(jìn)而破壞鈣磷代謝平衡，增加鈣流失量，加快骨丟失，從而加劇骨質(zhì)疏松，進(jìn)一步提高OVCF發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。

3.2 VDR基因多態(tài)性與老年OVCF的關(guān)系

VDR是介導(dǎo)1，25(OH)2D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，VDR基因多態(tài)性分別對(duì)應(yīng)BsmⅠ、TaqⅠ、ApaⅠ等多個(gè)酶切位點(diǎn)，至今已發(fā)現(xiàn)近13個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中Jawadi等[14]通過(guò)VDR基因多態(tài)性研究表明，限制性?xún)?nèi)切酶BsmI位點(diǎn)與鈣代謝關(guān)系最為密切。同時(shí)，國(guó)外學(xué)者報(bào)道指出，VDR受體基因序列rs1544410位點(diǎn)(BsmⅠ)多態(tài)性與骨質(zhì)疏松性椎體骨折存在一定關(guān)聯(lián)性[15-16]。研究還認(rèn)為，Bb基因型女性患骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)比正常人群高出3倍[17]。而本研究通過(guò)Logistic多因素回歸分析，VDR-Bb、bb基因型為老年OVCF發(fā)生的危險(xiǎn)因素，與An等[18]報(bào)道相似。VDR基因BsmI位點(diǎn)基因，分為突變型AA(BB)、突變型GA(Bb)及野生型GG(bb)3種，其中VDR-Bb、bb基因型一方面可抑制VD結(jié)合及活性，參與機(jī)體鈣磷及骨骼代謝調(diào)控過(guò)程；另一方面可在成骨細(xì)胞中廣泛表達(dá)，產(chǎn)生胰島素樣生長(zhǎng)因子，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，抑制細(xì)胞凋亡，刺激骨膠原轉(zhuǎn)錄與DNA合成，防止膠原降解，增加骨基質(zhì)沉積，并對(duì)骨治療產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用，繼而增加破骨細(xì)胞生成因子，破壞破骨與成骨過(guò)程之間平衡，影響骨吸收及骨礦化[19]。而VDR-BB基因型為老年OVCF發(fā)生的保護(hù)因素，原因考慮為：VDR-BB基因型可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的骨吸收活性，改善局部骨微環(huán)境內(nèi)骨吸收及骨形成平衡，促進(jìn)骨組織重建。

另外，VDR基因多態(tài)性可能影響VDR mRNA表達(dá)與穩(wěn)定性，降低靶基因轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致靶基因受體蛋白數(shù)目或活力出現(xiàn)輕微差異，從而影響鈣、磷吸收與釋放，導(dǎo)致不同VDR基因型患者鈣、磷代謝水平不一[20]。然而本研究表明，VDR-Bb型與bb型老年OVCF患者血磷、鈣濃度水平及胸椎、腰椎骨密度較為接近，與上述結(jié)果存在差異，原因可能與遺傳因素及環(huán)境因素等影響有關(guān)。另外，結(jié)果顯示VDR-Bb基因型老年OVCF患者Ⅰ型例數(shù)及椎體數(shù)明顯低于VDR-bb基因型患者，VDR基因型與骨折半定量分型具有顯著相關(guān)性(P<0.05)，推測(cè)與VDR-Bb基因型比較，VDR-bb基因型患者更易發(fā)生嚴(yán)重壓縮椎體骨折，充分說(shuō)明老年OVCF患者VDR不同基因型與骨折分型相互關(guān)聯(lián)，可為預(yù)測(cè)老年OVCF壓縮程度提供新方向，但關(guān)于其經(jīng)過(guò)何種方式調(diào)解骨折壓縮程度，是否與骨代謝、骨折風(fēng)險(xiǎn)等因素有關(guān)仍有待進(jìn)一步探討。

綜上可知，VDR-Bb、bb基因型可增加老年OVCF發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并與半定量分型存在一定關(guān)聯(lián)性，早期檢測(cè)VDR基因多態(tài)性，對(duì)評(píng)估OVCF壓縮程度具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。