白登彥 王冠 張海軍 朱濤 趙志鵬 尹秦 郭小榮

1.西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

2.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)退化導(dǎo)致的骨質(zhì)變化、骨脆性增加從而極易引發(fā)骨折的全身代謝性疾病[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，OP的發(fā)生是免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)以及骨髓微環(huán)境動(dòng)態(tài)失衡等共同作用的結(jié)果。骨髓微環(huán)境(bone marrow microenvironment，BMM)由成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、破骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子等成分組成。BMM能夠提供生理屏障，阻斷調(diào)控多種細(xì)胞的分化、凋亡的信號(hào)，其變化與多種信號(hào)因子存在密切關(guān)系，其中Runx 2、PPARγ、TGF-β1、Smad 4是BMM動(dòng)態(tài)平衡的重要指標(biāo)[3]。TGF-β1/Smad 4信號(hào)通路是由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (transforming growth factor，TGF-β1)和Smad 4構(gòu)成。研究[4-5]認(rèn)為，TGF-β1/Smad 4信號(hào)通路對(duì)骨細(xì)胞的形成、分化及凋亡具有一定的調(diào)節(jié)作用，但具體機(jī)制尚未完全闡明。研究[6-7]表明，針刺能夠改善骨微結(jié)構(gòu)，調(diào)控BMM，但其是否通過(guò)調(diào)控TGF-β1 /Smad4信號(hào)通路影響OP發(fā)病尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此本研究擬通過(guò)切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢的方法建立OP大鼠模型，給予電針刺激“腎俞穴”“三陰交穴”“關(guān)元穴”及“足三里穴”進(jìn)行干預(yù)，旨在觀察針刺對(duì)去卵巢大鼠TGF-β1 /Smad4信號(hào)通路的干預(yù)，并分析其對(duì)BMM的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取3月齡SPF級(jí)雌性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(甘)2019-0001，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)造模。本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程及操作均遵守國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)(NHNRC)動(dòng)物道德準(zhǔn)則。

1.1.2試劑及儀器：纖毛機(jī)械刺激針(NC12775，美國(guó)StoeltingCo.)，HANS-200A 電針儀(南京濟(jì)生)。戊酸雌二醇片(國(guó)藥準(zhǔn)字J20191038，規(guī)格：1 mg×21片，拜耳)。Runx2抗體 (批號(hào)：XGK100552)，PPARγ抗體(批號(hào)：WL01800)，TGF-β1抗體(批號(hào)：YS-0086R)，Smad4抗體(批號(hào)：XY-0585R)，全部購(gòu)自美國(guó)BioVision；BALP ELISAKit(批號(hào)：E202006)、CBF-α1 ELISAKit(批號(hào)：E202905)、CTX-I ELISAKit(批號(hào)：E202012)、PINP ELISAKit(批號(hào)：E202010)、OC ELISAKit(批號(hào)：E202014)，均購(gòu)自江蘇江萊生物。Benchmark Plus 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微型CT影像系統(tǒng)(西門子Inveon，德國(guó))；倒置相差熒光顯微鏡(日本，Olympus)；骨密度儀(韓國(guó)osteosys)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組與造模：將60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為4組：空白組(A組)、模型組(B組)、針刺組(C組)及雌二醇組(D組)，每組各15只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除空白組外，其他大鼠均參照文獻(xiàn)[8]去除卵巢，建立OP模型大鼠。造模成功后[9]進(jìn)行干預(yù)治療12周。

1.2.2干預(yù)：A、B組大鼠給予等劑量生理鹽水灌胃；C組按文獻(xiàn)[10]取穴，置于自制鼠袋固定大鼠，暴露針刺穴位，將毫針刺入穴位后，接電針儀，疏密波，刺激強(qiáng)度2 mA，2 Hz/100 Hz，每次15 min，1次/d；D組按照人鼠等效劑量給予戊酸雌二醇50 μg/(kg·d)灌胃，共治療12周。A、B組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，各組大鼠生長(zhǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)條件相同。

1.2.3骨代謝標(biāo)志物含量測(cè)定：將大鼠處死后心臟取血2 mL，置于離心機(jī)中，離心半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10 min，取上清液，采用ELISA法檢測(cè)血清中骨特異性堿性磷酸酶(bone specific alkaline phosphatase，BALP)、核結(jié)合因子-α1(core binding factor-α1，CBF-α1)、I型膠原羧基末端肽(cterminal type I collagen telopeptide，CTX-I)、I型前膠原氨基端前肽(procollagen type I amino-terminal peptide，PINP)、骨鈣素(osteocalcin，OC)含量水平。

1.2.4骨小梁微結(jié)構(gòu)及骨密度測(cè)定：采用Micro-CT掃描分離后的各組大鼠右側(cè)股骨遠(yuǎn)端干骺端。所有標(biāo)本從股骨遠(yuǎn)端生長(zhǎng)板頂點(diǎn)至皮質(zhì)部分去掉后為本次興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，提取圖像資料，用自帶骨骼分析軟件( advanced bone analysis, ABA ) 測(cè)定骨組織相關(guān)計(jì)量學(xué)指標(biāo)，包括：相對(duì)骨體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、連接密度(Conn.D)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)。通過(guò)骨密度儀分析各組大鼠骨密度(bone mineral density, BMD)變化。所有操作分析均由同一組人完成。

1.2.5TUNEL法檢測(cè)股骨遠(yuǎn)端細(xì)胞凋亡情況：取各組大鼠股骨組織剪碎后置于4 %多聚甲醛溶液內(nèi)浸泡24 h，不同濃度乙醇按順序脫水后，進(jìn)行切片操作，脫蠟后將標(biāo)本置于蘇木精中進(jìn)行染色15 min后脫水透明10 min，通過(guò)TUNEL試劑盒檢測(cè)不同組大鼠切片標(biāo)本中細(xì)胞凋亡情況，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6RT-PCR法檢測(cè)TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ mRNA表達(dá)：提取各組大鼠股骨遠(yuǎn)端部分骨組織，使用RNA抽提試劑盒提取不同組大鼠骨組織中總RNA，檢測(cè)RNA純度含量后用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)引物序列，RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠不同組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ mRNA表達(dá)量，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參對(duì)照，采用 2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列

1.2.7Western blot法檢測(cè)TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ蛋白表達(dá)：將大鼠處死后，迅速取其股骨遠(yuǎn)端的部分骨組織剪碎，加入RIPA裂解緩沖液放置在冰上30 min，提取各組大鼠骨組織中的總蛋白，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定各組大鼠骨組織中蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)用SDS-PAGE進(jìn)行等量分離，然后移至PDVF膜上，并置于4 ℃下添加一抗(1∶500)孵育過(guò)夜。洗滌后添加辣根過(guò)氧化物酶綴合的二抗(1∶500)，常溫下孵育2 h。ECL試劑顯影后應(yīng)用軟件QuantityOne對(duì)蛋白相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨代謝標(biāo)志物比較

與空白組比較，各組大鼠造模后骨代謝標(biāo)志物BALP、CBF-α1、PINP、OC含量明顯降低(P<0.05)，CTX-I含量明顯升高(P<0.05)；干預(yù)治療12周后，與模型組比較，雌二醇組大鼠和針刺組大鼠BALP、CBF-α1、CTX-I、PINP、OC改善程度優(yōu)于模型組(P<0.05)，且針刺組優(yōu)于雌二醇組明顯(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠骨代謝標(biāo)志物含量比較

2.2 大鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)及骨密度比較

與空白組比較，模型組大鼠造模后BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D、Tb.Sp、SMI均出現(xiàn)不同程度改變(P<0.05)；干預(yù)12周后，與模型組比較，雌二醇組大鼠和針刺組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D、Tb.Sp、SMI參數(shù)不同程度改變(P<0.05)；其中針刺組干預(yù)效果優(yōu)于雌二醇組(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 大鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)比較

2.3 大鼠股骨遠(yuǎn)端細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL染色提示藍(lán)色熒光為正常細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞。激光共聚焦顯示，空白組大鼠骨組織正常，綠色熒光極少；模型組大鼠造模后綠色熒光增多，提示成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡增加；干預(yù)治療后，針刺組和雌二醇組大鼠股骨遠(yuǎn)端成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠股骨遠(yuǎn)端細(xì)胞凋亡情況比較

2.4 大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ mRNA表達(dá)量比較

與空白組比較，各組大鼠造模后股骨遠(yuǎn)端骨組織中TGF-β1、Smad4 mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，Runx2、PPARγ mRNA表達(dá)量明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)12周后，各治療組大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織中TGF-β1、Smad4表達(dá)量明顯上升(P<0.05)，Runx2、PPARγ mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.05)；其中針刺組和雌二醇組大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ mRNA的表達(dá)效果優(yōu)于模型組(P<0.05)，針刺組明顯優(yōu)于雌二醇組(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 骨組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ mRNA表達(dá)量比較

2.5 大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ蛋白表達(dá)量比較

與空白組比較，各組大鼠造模后股骨遠(yuǎn)端骨組織中TGF-β1、Smad4 蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，Runx2、PPARγ 蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)12周后，各治療組大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織中TGF-β1、Smad4蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.05)，Runx2、PPARγ 蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05)；其中針刺組和雌二醇組大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ 蛋白的表達(dá)效果優(yōu)于模型組(P<0.05)，針刺組明顯優(yōu)于雌二醇組(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 股骨遠(yuǎn)端骨組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ蛋白表達(dá)量比較

3 討論

OP發(fā)病原因與骨組織代謝異常、骨髓微環(huán)境改變等多種因素有關(guān)[11]。隨著近幾年激素使用過(guò)多，人口老齡化加快，OP患者正在逐年增長(zhǎng)[12]。中醫(yī)學(xué)將骨質(zhì)疏松歸為“骨痿”“骨枯”范疇，辨證該病時(shí)多從腎脾等入手。張介賓[13]指出：“水谷之海先天為之主，精血之海后天為之資……先天不足者，后天培養(yǎng)之，亦可居其強(qiáng)半”。說(shuō)明腎精氣充足與脾胃功能密切相關(guān)，脾胃健旺，則水谷精微化源充盛，骨骼強(qiáng)盛。骨髓微環(huán)境異常時(shí)，腎主骨生髓之功能也異常，進(jìn)而可至骨痿，正如《素問(wèn)·脈要精微論》所述“骨者，髓之府，轉(zhuǎn)搖不能，腎將憊矣”，《素問(wèn)·痿論》言：“腎氣熱則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，這也說(shuō)明“腎將憊”與“腎氣熱”與腦的生理功能異常存在著密切的聯(lián)系。針刺能夠明顯調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境，改善骨微結(jié)構(gòu)，修復(fù)成骨細(xì)胞增長(zhǎng)、改善骨質(zhì)量，但其具體機(jī)制仍不明確[14-16]。研究[17-19]指出，“腎俞穴”“三陰交穴”“關(guān)元穴”及“足三里穴”是補(bǔ)腎健脾重要穴位，而且對(duì)于OP的發(fā)生發(fā)展有重要影響。因此，本次研究在此基礎(chǔ)上選擇了上述穴位。

BMD是目前臨床檢測(cè)骨質(zhì)疏松變化的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，大鼠在卵巢摘除后，其BMD明顯降低，骨小梁微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，證明成功建立OP模型。PINP作為I型前膠原細(xì)胞外分泌產(chǎn)物是骨形成的敏感指標(biāo)，CTX-I是骨吸收過(guò)程中I型膠原釋放入血的產(chǎn)物。血液中PINP及CTX- I含量變化與I型膠原的合成速率、成骨細(xì)胞活動(dòng)情況以及骨吸收過(guò)程密切相關(guān)，是診斷OP的特異性指標(biāo)[20-21]。CBF-α1屬于Runt結(jié)構(gòu)域基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，由成骨細(xì)胞特異性表達(dá)，對(duì)成骨細(xì)胞的分化的起重要作用。研究[22]指出，CBF-α1能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，調(diào)控骨細(xì)胞的功能因子表達(dá)，對(duì)骨骼形成和發(fā)育有重要作用。OC又稱骨R-羥基谷氨酸蛋白，主要由成骨細(xì)胞、成牙質(zhì)細(xì)胞合成，作為成骨細(xì)胞分泌的特殊非膠原蛋白，其含量變化可用于監(jiān)測(cè)骨發(fā)育以及骨代謝情況，在調(diào)節(jié)骨鈣代謝中起重要作用[23]。在OP中，CTX-I、CBF-α1以及OC均能特異性反映骨髓微環(huán)境平衡情況。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠血清中BALP、CBF-α1、CTX-I、PINP、OC等骨代謝標(biāo)志物含量明顯改變，這表明去卵巢大鼠造模后骨量出現(xiàn)丟失，這與OP的病理表現(xiàn)相符。與模型組比較，針刺干預(yù)后大鼠骨代謝相關(guān)標(biāo)志物水平明顯改善，BMD含量明顯增加，骨小梁微結(jié)構(gòu)及骨髓微環(huán)境明顯改善，這與王亞軍[24]、邵雨薇[25]等的研究結(jié)果一致。

骨髓微環(huán)境紊亂與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的骨代謝特點(diǎn)非常相似，而骨髓微環(huán)境平衡是多種因素共同作用的結(jié)果[26]。其中Runx2 和 PPARγ能夠調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞這兩種細(xì)胞方向分化，是骨髓微環(huán)境動(dòng)態(tài)變化的重要指標(biāo)因子[27-28]。TGF-β1是調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境中骨吸收和骨形成的重要多肽類生長(zhǎng)因子，Smad4是TGF-β1跨膜傳導(dǎo)多種信號(hào)所需的重要分子之一，TGF-β1/Smad4信號(hào)通路在骨髓微環(huán)境的平衡調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要機(jī)制[29-30]。但針刺是否通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad4信號(hào)通路影響OP的骨髓微環(huán)境仍不明確。本研究結(jié)果顯示，大鼠造模后股骨遠(yuǎn)端骨組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ表達(dá)含量明顯改變，但經(jīng)針刺干預(yù)后，骨組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ趨向好轉(zhuǎn)，這提示針刺能夠調(diào)節(jié)OP大鼠TGF-β1/Smad4信號(hào)通路的表達(dá)，進(jìn)而影響OP骨髓微環(huán)境改變。

綜上所述，針刺能夠影響去卵巢大鼠骨髓微環(huán)境改變，改善骨代謝標(biāo)志物表達(dá)，調(diào)控骨代謝平衡，其機(jī)制可能與針刺調(diào)控TGF-β1/Smad4信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。