乳酸桿菌對新生鼠和成年鼠輔助性T細胞1/輔助性T細胞2平衡及肺樹突狀細胞表型的影響

謝娜，劉崇海，皮光環(huán)，雷勛明，蔡艷，劉昊昊，李小林

(1.四川省婦幼保健院，四川成都 631000；2.川北醫(yī)學院，四川南充 637000)

近幾十年來過敏性疾病發(fā)病率逐年增加，已成為嚴重的公共問題和疾病負擔[1]。我國嬰幼兒過敏性疾病患病率正逐漸接近發(fā)達國家和地區(qū)水平[2]。大多數(shù)過敏性疾病都從兒童開始發(fā)病，因此早期預防意義重大[3]。動物模型證實腸道菌群對免疫系統(tǒng)發(fā)育有著重要意義[4]。有研究顯示過敏患兒腸道菌群腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯減少[5]，提示腸道菌群與過敏性疾病密切相關。人類生命早期輔助性T細胞(Th)1/Th2平衡以Th2為優(yōu)勢細胞，已有的研究顯示包括乳酸桿菌的益生菌可以促進Th1分化[6]，如果早期進行乳酸菌干預，是否可以改變Th1/Th2平衡狀態(tài)，進而達到預防過敏性疾病的目的？因此，我們在新生小鼠和成年小鼠予以乳酸桿菌干預，探討乳酸桿菌干預對新生鼠和成年鼠Th1/Th2平衡和肺樹突狀細胞表型的影響，為生命早期乳酸桿菌干預預防過敏性疾病的發(fā)生提供參考。

1 資料和方法

1.1 材料

清潔級BALB/c小鼠分籠飼養(yǎng)于標準飼養(yǎng)籠，孕鼠懷孕20 d后所產(chǎn)新生鼠在同樣環(huán)境中飼養(yǎng)。本實驗使用的乳酸桿菌是從正常人糞便分離所得，通過革蘭染色、觸酶實驗，API-CH50系統(tǒng)鑒定。將乳酸桿菌接種于乳酸桿菌選擇性(LBS)培養(yǎng)基，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h后，收集乳酸桿菌，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，血球計數(shù)池計數(shù)并將乳酸桿菌調整為109CFU/mL濃度。

1.2 方法

1.2.1 乳酸桿菌處理 新生鼠從出生后連續(xù)7 d每天經(jīng)口給予109CFU/mL濃度乳酸桿菌10 μL，利于乳酸桿菌定植。成年鼠選取滿6周的小鼠連續(xù)7 d每天經(jīng)口給予109CFU/mL濃度乳酸桿菌50 μL，實驗第8天進行盲腸內容物培養(yǎng)以確定乳酸桿菌腸道定植情況。

1.2.2 實驗分組 新生鼠和成年鼠各40只，小鼠分為兩部分，第一部分40只，用于腸道菌群計數(shù)，其中新生鼠20只，隨機分為乳酸桿菌組和對照組各10只。乳酸桿菌組出生后連續(xù)口飼乳酸桿菌7 d，對照組用等量生理鹽水代替乳酸桿菌進行實驗。第8天小鼠處死后取盲腸內容物作乳酸桿菌培養(yǎng)計數(shù)。成年鼠20只同樣分為乳酸桿菌組和對照組，處理同前。第二部分40只小鼠分組同第一部分，在最后1次口飼乳酸桿菌后3周，取眼眶血的血清用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測，取肺組織制備單個細胞懸液用于流式細胞儀檢測。

1.2.3 細菌培養(yǎng) 參考文獻[7]方法，取盲腸內容物加無菌稀釋液，稀釋成10-6～10-1稀釋度，進行腸桿菌(伊紅美蘭EMB培養(yǎng)基)、腸球菌(EC培養(yǎng)基)、乳酸桿菌(LBS培養(yǎng)基)、雙歧桿菌(BS培養(yǎng)基)培養(yǎng)和計數(shù)。結果單位CFU/g。

1.2.4 細胞因子檢測 血清細胞因子濃度檢測采用ELISA試劑盒。小鼠干擾素γ(IFN-γ)和白細胞介素10(IL-10)試劑盒購于R&D公司(USA)。白細胞介素4(IL-4)購于Bender公司(Austria)。按試劑說明書進行操作，ELISA酶標儀于450 nm處檢測吸光度。

1.2.5 流式細胞儀檢測 小鼠肺研磨后，300目篩網(wǎng)過濾，制成單個細胞，取10 mL經(jīng)紅細胞裂解液處理10 min后，PBS洗2次，血球計數(shù)池計數(shù)后，取兩份等體積含細胞數(shù)為106懸液分別加入兩支試管。陽性管加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的單克隆抗小鼠CD11C和E/Cy5標記的單克隆抗小鼠CD8α以及PE標記的單克隆抗小鼠主要組織相容性復合體MHC-Ⅱ類分子抗體，陰性管加入FITC標記的單克隆抗小鼠CD11C以及PE/Cy5和PE標記的同型對照抗體(抗體均為BioLegend公司產(chǎn)品)，每種抗體各加1 μg，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗 3次，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 腸道菌群檢測

通過口飼乳酸桿菌，乳酸桿菌干預的新生鼠乳酸桿菌數(shù)量較對照組增加，而腸球菌和腸桿菌數(shù)量降低(P<0.01)；乳酸桿菌干預的成年鼠腸道乳酸桿菌數(shù)量增加(P<0.01)，但腸道腸球菌和腸桿菌數(shù)量變化差異無統(tǒng)計學意義，提示新生鼠腸道菌群相對于成年鼠更容易受環(huán)境因素影響。見表1。

表1 兩組腸道菌群數(shù)量比較 log10n/g

2.2 免疫指標檢測

乳酸桿菌干預的新生鼠IFN-γ和IL-10水平較對照組高(P<0.05)，兩組IL-4水平比較差異無統(tǒng)計學意義。乳酸桿菌干預的成年鼠IFN-γ、IL-4和IL-10水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。提示乳酸桿菌干預對新生鼠有影響，可以提高IFN-γ水平，促進Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，但乳酸桿菌干預對成年鼠沒有明顯影響。見表2。

表2 兩組小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-10水平比較 pg/mL

2.3 肺樹突狀細胞表型檢測

乳酸桿菌干預的新生鼠肺部CD11c+CD8α-水平為92.34%±0.94%，較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時新生鼠干預組CD11c+CD8α+水平較對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；提示乳酸桿菌干預可以促使Th1/Th2平衡向Th1方向偏移。對照組新生鼠肺部僅11.48%±1.73%的樹突狀細胞(DC)表達MHCⅡ類分子，說明外周組織中以未成熟DC為主，經(jīng)過乳酸桿菌干預后，新生鼠肺部14.03%±1.14%的DC表達MHCⅡ類分子，較對照組明顯增加，提示乳酸桿菌可以刺激肺部DC成熟。成年鼠乳酸桿菌干預組CD11c+CD8α-、CD11c+CD8α+和CD11c+MHCⅡ+水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組小鼠肺部DC亞型和成熟度的流式檢測水平比較 %

3 討論

通過給小鼠口飼乳酸桿菌，腸道菌群檢測顯示無論新生鼠還是成年鼠，乳酸桿菌數(shù)量均明顯增高，但對于其他腸道菌群的影響，兩組小鼠反應有差異。新生鼠乳酸桿菌數(shù)量增加，明顯影響腸道的腸球菌和腸桿菌數(shù)量，而成年鼠雖然乳酸桿菌數(shù)量明顯增加，但對其他腸道菌群影響不大，提示生命早期腸道菌群不穩(wěn)定，很容易被環(huán)境因素干擾。

Th1/Th2平衡在過敏性疾病中至關重要[8-10]。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等，IL-4可以促進B細胞完成IgE抗體類型轉化，在過敏性疾病中發(fā)揮重要作用[11-12]。Th1分泌IFN-γ可以抑制Th2的分化和功能[13]。調節(jié)性T細胞(Treg細胞)是機體對T細胞活化的一種負反饋調節(jié)機制，將T細胞參與的免疫反應控制在一個適當?shù)姆秶鷥龋粚C體造成損傷，通過分泌可溶性分子如IL-10、轉化生長因子等調節(jié)免疫功能。通過對相關細胞因子水平檢測發(fā)現(xiàn)，成年鼠口飼乳酸桿菌后對IL-4、IFN-γ和IL-10沒有明顯影響，但是在新生鼠乳酸桿菌可以明顯提高IFN-γ和IL-10水平，本研究結果顯示乳酸桿菌干預對IL-4的影響不大。分析原因可能是成年鼠已經(jīng)接受多種抗原刺激，腸道菌群和免疫系統(tǒng)均發(fā)育成熟，不易受環(huán)境影響。相關研究顯示，嬰幼兒出生后數(shù)小時細菌開始在腸道定植，約3歲時形成與成人相似的穩(wěn)定腸道菌群構成[14]，而新生鼠出生后，無論是腸道菌群還是免疫系統(tǒng)均處于逐漸發(fā)育的過程，在此過程中對外界刺激會出現(xiàn)不同的反應，兩者均容易受外界因素影響。國內有研究顯示，嗜酸乳桿菌La28在干預第14天和第28天時小鼠血清Th2因子IL-6含量降低，嗜酸乳桿菌6091干預28 d時血清IL-6含量降低，而植物乳桿菌LP45、鼠李糖乳桿菌GG對小鼠Th1/Th2平衡沒有影響[15]，提示不同乳酸桿菌菌株對免疫系統(tǒng)的影響有所不同[16]。

DC是功能最強的專職抗原遞呈細胞(antigen presen-ting cells，APC)，是唯一可激活初始T淋巴細胞的APC[17]。DC高水平表達MHC Ⅱ類分子可表達參與抗原攝取和轉運的特殊膜受體[18]；有效攝取和處理抗原，然后遷移至T細胞區(qū)；提高抗原提呈效率，少量抗原和DC即可激活T細胞。體內DC按其發(fā)育程度可分為成熟DC和未成熟DC。正常情況下，體內絕大多數(shù)DC處于未成熟狀態(tài)，未成熟DC有很強的吞噬能力，低表達MHCⅡ和共刺激分子如CD80、CD83或CD86，有很強的外周組織監(jiān)視能力[19]。成熟DC高表達MHCⅡ類分子和共刺激分子具有很強激活T細胞的能力。不同DC亞型對Th1/Th2平衡影響不同，CD8α-DC則可促進Th2發(fā)育，CD8α+DC則促進Th1分化[20]。

本研究結果顯示，成年鼠乳酸桿菌干預對小鼠DC亞型和成熟度均沒有明顯影響，但是在新生鼠模型中，乳酸桿菌干預可以對兩者均產(chǎn)生明顯的影響，表現(xiàn)為乳酸桿菌干預可以上調CD11c+CD8α+DC表達，下調CD11c+CD8α-DC表達，同時CD11c+MHCⅡ+表達較對照組明顯增高。再次說明乳酸桿菌可以促進機體向Th1優(yōu)勢發(fā)展，同時可以促進DC的成熟度。而相關研究提示益生菌可以影響T細胞亞群分化，促進Th1介導的免疫反應，進一步抑制IgE抗體的產(chǎn)生從而調節(jié)過敏反應[21]，也有相關研究提示生命早期乳酸桿菌干預可以促進新生鼠Th1/Th2平衡向Th1方向偏移[22]，對成年鼠免疫狀態(tài)沒有影響[23]，可能是生命早期乳酸菌干預可以預防過敏性疾病的機制。

綜上所述，乳酸桿菌干預可以提高新生鼠IFN-γ和IL-10水平，上調CD11c+CD8α+DC、CD11c+MHCⅡ+表達，下調CD11c+CD8α-DC表達，而在成年鼠中沒有明顯變化，說明乳酸桿菌干預對新生鼠的影響與成年鼠有一定差異，生命早期可以促進新生鼠Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，而對成年鼠沒有影響。