藏藥水母雪蓮黃酮類抗腫瘤免疫效應(yīng)的初步研究

張燕麗 岳秋娟 陳香君 張敏

摘要：目的 初步探討藏藥水母雪蓮SMM（Saussurea medusa Maxim）的抗腫瘤免疫功能，為進(jìn)一步開發(fā)水母雪蓮藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。方法 建造lewis荷瘤小鼠模型后，隨機(jī)分為生理鹽水組（normal saline，NS）、SMM黃酮類組和環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）組，體外治療14天。以lewis荷瘤小鼠腫瘤組織HE形態(tài)染色以及血清中IL-2和IFN-γ為檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果 lewis荷瘤小鼠經(jīng)SMM黃酮類提取物治療后，腫瘤浸潤(rùn)組織部位的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)局灶性或者片狀壞死并伴有新生血管形成;還提高了荷瘤小鼠血清中IL2和IFN-γ的含量。結(jié)論 水母雪蓮黃酮類提取物有一定抗肺癌免疫治療的效應(yīng)。

關(guān)鍵字：水母雪蓮;抗腫瘤效應(yīng)

[Abstract] Objective To preliminarily explore the anti-tumor immune function of Saussurea medusa Maxim （Saussurea medusa Maxim）， and provide scientific basis for further development of the medicinal value of Saussurea medusa Maxim. Methods After the lewis tumor-bearing mouse model was constructed， they were randomly divided into normal saline ， SMM flavonoids and cyclophosphamide groups. They were treated in vitro for 14 days.The HE morphological staining of tumor tissue and serum IL-2 and IFN-γ in Lewis tumor-bearing mice were used as the detection indicators. Results After lewis tumor-bearing mice were treated with SMM flavonoids extract， focal or patchy necrosis of tumor cells and neovascularization were found in tumor infiltrating tissues; it also increased the levels of IL2 and IFN-γ in serum of tumor-bearing mice. Conclusion The flavonoid extract of Saussurea medusa has a certain anti-lung cancer immunotherapy effect.

腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的一種疾病。其中肺癌的發(fā)病率逐年增高，也是致死率最高的癌癥之一。其主要治療方法包括手術(shù)、放療和化療等，但是該治療方案會(huì)導(dǎo)致患者免疫功能紊亂，預(yù)后差[1]。近幾年隨著人們對(duì)腫瘤治療的不斷研究和深入，發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤的綜合治療中，中醫(yī)藥可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用且毒副作用小[2]。因此本文采用lewis荷瘤小鼠為研究對(duì)象，初步探討藏藥水母雪蓮黃酮類的抗腫瘤作用，以期為腫瘤臨床治療及靶向藥物開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料

SPF級(jí)野生型C57BL/6小鼠（6～8周齡、20～25 g）購(gòu)于達(dá)科為生物公司，飼養(yǎng)于西藏民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。Lewis肺癌細(xì)胞株3LL由上海復(fù)旦大學(xué)贈(zèng)予。水母雪蓮選擇西藏山南野生品種。CTX購(gòu)自江蘇恒瑞制藥公司。多聚甲醛、二甲苯購(gòu)于武漢科瑞生物技術(shù)有限公司。鼠IL-2（高敏）試劑盒、小鼠IFN-γ（高敏）試劑盒購(gòu)自深圳欣博盛生物科技公司。

1.2植物樣本處理

100 g水母雪蓮中加入70%乙醇，于 60℃、50 min條件下提取2次，提取物凍干處理后得黃酮粗品。10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)基為溶劑，按實(shí)驗(yàn)要求配制成水母雪蓮黃酮溶液5 g/L。

1.4 Lewis肺癌荷瘤小鼠模型的建立與分組治療

將1×106個(gè)/mL的3LL單細(xì)胞懸液接種于小鼠腹股溝皮下，第5-7天， 能明顯觸摸到腫瘤結(jié)節(jié)（直徑約1 cm）則建模成功。建模成功后，隨機(jī)將接種小鼠分為生理鹽水組（NS）、SMM黃酮組、環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組（CTX），每組8只。每天早上同一時(shí)間陰性對(duì)照組給予生理鹽水灌胃20mL·kg-1·d-1;SMM組分別給予5 mg·ml-1灌胃，10mL·kg-1·d-1;CTX組隔天一次給予環(huán)磷酰胺腹腔注射50 mg·kg-1 CTX ，連續(xù)治療14 d。

1.5 HE染色

給藥結(jié)束的第二天，將已固定的腫瘤組織常規(guī)脫水、包埋和切片后HE染色，光鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。病理學(xué)形態(tài)觀察交由成都里來(lái)生物科技有限公司檢測(cè)。

1.6 ELISA檢測(cè)IL-2、IFN-γ的表達(dá)

給藥結(jié)束的第二天，各組荷瘤小鼠脫頸椎前摘眼球取血，離心分離血清。按照IL-2和IFN-γ試劑盒說(shuō)明書操作，將酶標(biāo)儀設(shè)置490 nm檢測(cè)各孔吸光度（A）值并計(jì)算IL-2和IFN-γ水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism軟件處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s 表示，組間比較One-ANOVA分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMM黃酮類對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤浸潤(rùn)組織HE染色的影響

腫瘤組織HE染色觀察可見，NS對(duì)照組瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞異形性較大。CTX陽(yáng)性組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)局灶性或者片狀壞死，細(xì)胞核固縮。與NS組和CTX組相比，SMM組腫瘤細(xì)胞大小基本一致，細(xì)胞多呈圓形，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)局灶性或者片狀壞死，少量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，腫瘤間可見少量的腫瘤細(xì)胞壞死形成的空泡和少量的新生血管形成。（如圖1）。

2.2 SMM黃酮類可顯著提高Lewis荷瘤小鼠血清IL-2和IFN-γ含量

與NS組比較（圖2），SMM黃酮組荷瘤小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量極顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與CTX組相比，SMM黃酮組IL-2和IFN-γ含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

水母雪蓮又稱水母雪兔子，屬菊科風(fēng)毛菊屬，是青藏高原分布較廣，產(chǎn)量較大的雪蓮花藥材，經(jīng)證實(shí)水母雪蓮的乙醇、甲醇和水提物以及純化出的多糖、單體黃酮類化合物均有著明顯的抗腫瘤、抗風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、抗菌消炎和抗氧化等藥理活性[3]。研究表明水母雪蓮提取物對(duì)腹水型肝癌、S180癌細(xì)胞具有直接的殺傷作用[4]。但其是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)患者免疫功能從而達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)的研究相對(duì)較少。

本研究以SMM黃酮類提取物為對(duì)象，探討了SMM的抗腫瘤作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SMM黃酮類提取物不僅能夠促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)組織的腫瘤細(xì)胞壞死，還能幫助腫瘤間形成空泡并伴有新生血管形成。此外，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)SMM黃酮類提取物處理的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清中的IL2、IFN-γ含量顯著增加。眾所周知，細(xì)胞因子是抗腫瘤免疫效應(yīng)的重要評(píng)估指標(biāo)[5]，其中IFN-γ主要由活化的CTL細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、NK細(xì)胞等產(chǎn)生，可通過(guò)促進(jìn)MHC-II類分子的表達(dá)從而增強(qiáng)APC細(xì)胞的抗原呈遞能力;還可通過(guò)促進(jìn)MHC-I類分子表達(dá)以增強(qiáng)CTL細(xì)胞的殺傷活性，此外還可輔助刺激IL-2、TNF等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[6]。提示SMM黃酮類提取物可以顯著上調(diào)腫瘤環(huán)境下正調(diào)控細(xì)胞因子的分泌以達(dá)到抗腫瘤免疫效應(yīng)。

綜上所述，SMM黃酮類提取物能夠改善和恢復(fù)機(jī)體免疫功能，間接達(dá)到抗腫瘤的作用。促進(jìn)正向細(xì)胞因子的分泌，從而抑制殺死腫瘤并促進(jìn)腫瘤局部新生血管的形成。值得今后進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 崔益雯，王杰，陳騰.中藥調(diào)節(jié)腫瘤免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展[J].腫瘤，2019，39（08）：674-679.

[2] 宋磊， 張嵐， 唐敏， 等. 中醫(yī)藥在惡性腫瘤整合醫(yī)學(xué)療法中的運(yùn)用[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)， 2018， 33（5）：23-26.

[3] 達(dá)娃卓瑪.西藏產(chǎn)雪蓮花的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2015，24（12）：25-31.

[4] 楊璐銘，陳虎彪，郭喬如，等.雪蓮的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2020，55（07）：1466-1477.

[5] Conlon KC， Miljkovic MD， Waldmann TA. Cytokines in the Treatment of Cancer[J]. J Interferon Cytokine Res. 2019 Jan;39（1）：6-21.

[6] Schoenborn JR， Wilson CB. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses[J]. Adv Immunol. 2007;96：41-101.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81860719）;西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（XZ2017ZRG-59，XZ2018ZRG-72）;西藏民族大學(xué)新冠肺炎疫情應(yīng)急項(xiàng)目（XZMDYJ04）;西藏自治區(qū)科技廳自然基金（2021年）。

作者簡(jiǎn)介：張燕麗（1988-），女，碩士，講師，主要從事藏藥抗腫瘤免疫研究

通訊作者：張敏（1971-），女，博士，教授，主要從事抗腫瘤免疫研究

（西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部 自治區(qū)生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室 陜西 咸陽(yáng) 712082）